食品中微生物检验的质量控制

食品微生物检验的质量控制广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心内容食品微生生物检验验质量控控制概述述食品微生生物检验验的室内内质量控控制食品微生生物检验验的室间间质量控控制食品微生生物检验验质量控控制概述述一、质量量控制相相关定义义质量控制制：满足足质量要要求的操操作技术术和活动动。质量保证证：为了了满足实实验室质质量要求求，制制定相应应的计划划并实施施所进行行的一系系列系统统活动质量手册册：是描描述质量量系统元元素的文文件或文文件的集集合。二、食品品微生物物检验质质量控制制概念质量控制制是食品微微生物学学实验室室为了保保证检验验结果实实事求是是地反映映客观存存在而建建立的操操作程序序体系。。三、食品品微生物物检验质质量控制制目的食品微生生物学的的质量控控制是保证食食源性致致病菌的的培养、、分离、、鉴定及及血清学学试验等等的准确确性，避避免因操操作变化化导致检检验结果果错误。。四、质量量控制分分类分为室内质量量控制和室间质量量评价两个组成成部分室内质量量控制：：实验室室内部采采取的以以对比分分析、跟跟踪以及及对实验验室工作作的连续续性控制制计划。。室间质量量评价：：通过互互相校准准和/或或检验对对实验室室的操作作和结果果所进行行的评价价。五、质量量控制内容室内质量量控制实验室内内部质量保证证的核心心和基础础室间质量量评价外部组织织或机构构质量评价价食品微生生物学检检验室内质量量控制室内质量量控制一、对检检验人员员的要求求二、操作作手册三、检测测环境要要求四、设备备/仪器器要求五、仪器器设备的的功能监监测六、培养养基的质质量控制制七、试剂剂、染色色液及抗抗血清的的质控八、检验验过程的的质量控控制九、标准准菌株的的来源和和保存十、实验验室安全全防护一、对检检验人员员的要求求相应岗位位的人员员，应具具备相应应的技术术能力，，相应的的技术能能力证明明（证书书及证件件）。微生物检检验室应应有相应应技术能能力的人人负责室室内的技技术工作作，并设设立质量量监督员员。一、对检检验人员员的要求求高度的主主观判断断力

个人的技技能、经经验细菌学的的专业水水平培训班实验室进进修学术交流流专业期刊刊二、操作作手册各级人员员的职责责和权限限实验室安安全措施施样品采集集和处理理指南培养基和和试剂的的配制方方法….等等等三、检测测环境要要求-房房屋要求求房屋要求求：足够够宽敞、、通风、、有良好好的照明明。房屋内墙墙面及地地等应采采用易于于清洁的的材料。。房间的设设置应根根据工作作内容加加以分用用，设立立专用房房间。三、检测测环境要要求-环环境设施施要求专用房间间的温湿湿度控制制与记录录（样品品存放室室）特殊环境境的微生生物指标标控制与与记录（（无菌室室等）专用工作作室的标标准操作作规程和和定期的的检测校校准程序序。（洁洁净室等等）特殊环境境中的专专用设施施质量控控制应符符合有关关要求（（净化工工作台））三、检测测环境要要求食品微生生物学检检验室要要求布局局合理，，操作区区域与办办公区域域分开。。洗涤室室、培养养室、消消毒间、、无菌室室应分开开。无菌菌室要设设有套间间或缓冲冲间。微微生物检检验室应应备有自自动或脚脚踩式洗洗手池和和固定的的消毒设设施。三、检测测环境要要求微生物检检验室应应制定合合理、完完善的卫卫生管理理制度，，采用湿湿式保洁洁，定期期对操作作环境进进行消毒毒。对废废弃物，，应投入入指定的的容器内内，经无无害化处处理后方方可排放放，，以以防某些些病原微微生物传传播。三、检测测环境要要求需在无菌菌条件下下工作的的区域应应以明确确标识并并能有效效地控制制、监测测和记录录。每天天记录环环境检测测报告，，并经常常进行空空气落菌菌实验：：定期对对无菌室室进行室室内环境境消毒。。三、检测测环境要要求-环环境设施施的相关关技术指指标净化室、、净化工工作区域域、洁净净环境按按国家及及部颁标标准进行行检测。。空气洁净净度指标标：检测频率率及检测测方法。。一次//月；空空气细菌菌检测（（沉降法法）。级别≥0.5μm尘粒(个/L)≥5μm尘粒(个/L)活菌颗粒平均数(cfu/平板)100≤3.5≤0.0≤1.010000≤350.0≤2.5≤3.0四、设备备/仪器器要求--总则满足开展展相关检检测项目目的要求求。制定相关关设备//仪器的的作业指指导书。。设备/仪仪器需进进行检定定校准。。设备/仪仪器的运运行状况况记录。。维修后设设备/仪仪器的再再校准或或检查，，应具有有完整的的检查记记录。温度计实验室必必须要有有工作温温度计和和参照温温度计。。工作温度度计：用用于日常常温度检检查。参照温度度计：用用于校正正工作的的温度计计。温度计运运行检查查：一般般可采用用一次//半年的的运行检检查。日常检查查、校准准检查、、运行检检查等都都应做好好相应的的记录。。培养箱、、水浴箱箱和冰箱箱的温度度控制培养箱的的温差要要求，一一般显示示值与实实测值相相差不大大于±1℃，箱箱体内各各点温差差（内部部的温度度均衡性性）以及及温度波波动同样样不大于于±1℃℃。温度监控控方法：：可将工工作温度度计置甘甘油中，，放入待待测箱体体内，观观察工作作温度计计的温度度，最好好1-2次/天天监控并并记录。。高压灭菌菌锅的温温度控制制（一））高压灭菌菌锅；可可用生物物指示菌菌法（常常用）、、化学变变色纸片片及高压压灭菌锅锅温度计计等方法法进行检检测。生物指示示菌法是是一种高高压灭菌菌锅的效效果显示示法。高压灭菌菌锅由专专人操作作，并做做好作业业记录。。高压灭菌菌锅使用用时，内内置物品品不能太太多，单单位体积积内的内内容物（（每瓶内内的培养养基）不不能太多多。高压灭菌菌锅的温温度控制制（二））高压灭菌菌锅温度度波动范范围：110，，115和121±2℃。高压灭菌菌锅校准准周期一一般在半半年。干燥灭菌菌箱温度度控制干燥灭菌菌箱的温温度校准准：用参参考温度度计进行行温度测测试。干燥灭菌菌箱温度度要求与与精确度度：160±5℃或或180±5℃。。干燥灭菌菌箱校准准周期一一般为一一年。培养基配配制用蒸蒸馏水的的控制按设备说说明，定定期清洁洁离子交交换器和和更换离离子交换换材料。。检测要求求：西欧欧标准为为微生物物检验用用蒸馏水水的特定定电导率率＜0..5ms/m；细菌数＜＜50cfu/ml。。我们日常常用的标标准为＜＜10ms/m。检测频率率：1次次/每月月。蒸馏水定定点供应应，并做做好相应应的质量量控制及及记录。。天平的管管理天平放置置要求：：无振动动、无气气流影响响及水平平台面上上。天平要有有使用记记录。天平作为为计量仪仪器是列列入国家家强制检检定的范范围，一一般1次次/年进进行检定定。容积的控控制（一一）保证高压压灭菌后后的稀释释剂满足足标准用用量。采取称中中法来测测定蒸发发量，体体积100ml的稀释剂剂起重量量为101g。高压结束束体积偏偏差不得得超过1%。采取先高高压后定定量分装装，可避避免因高高压造成成的体积积误差。。对保存的的定量液液体应在在使用时时，注意意补充容容积。容积的控控制（二二）吸管的控控制：通通过小计计量容器器校准后后使用。。小计量容容器吸管管、容量量瓶、量量筒等玻玻璃器皿皿，校准准周期一一般为1-2次次/一年年。小计量容容器日常常使用检检查可每每周进行行一次，，包括容容器的完完整性，，并做好好相应的的记录。。pH计pH计使用前前应用标标准液进进行校准准。缓冲液使使用有效效期：PH4..00约1年PH7..00约6个月月pH9..00约6个月月pH计的维护护：电极极外表的的定期清清洗；电极敏感感性检测测及极性性恢复。。净化工作作台的控控制水平流净净化工作作台工作作区域，，要求洁洁净度为为100级。空空气沉降降30min，，细菌数＜＜1个//皿。垂垂直流净净化工作作台，细细菌数＜＜0.49个//皿.净化工作作台运行行检查频频次：1次/月月，采用用细菌沉沉降检测测。净化工作作台高效效过滤膜膜一般为为一年更更换一次次，并同同时进行行粒子与与细菌沉沉降检测测。紫外线灯灯的控制制检测方法法：仪器器测试法法和生物物测试法法。前者是通通过专用用仪器检检测紫外外灯管发发射的紫紫外光强强度。国国家消毒毒技术规规范中表表明在距距离照射射源1米米处，要要求其强强度为90lx。生物测试试法：采采用一定定的菌培培养物，，经一定定比例稀稀释，菌菌量控制制在200-250个个/0..5ml，涂布平板板在紫外外灯光下下照射2min，，同时设置置普通光光源的对对照组，，置37℃培养养48h，计算其杀杀灭率，，要求杀杀灭率达达99%%。显微镜的的控制显微镜应应有作业业指导书书，日常常维护记记录及自自校记录录。显微镜应应置于无无振动、、避免灰灰尘、防防潮等要要求的环环境。其它微生生物检测测专用仪仪器的控控制细菌鉴定定仪、酶酶标仪等等设备，，工作中中常用阳阳性对照照检测其其功能的的正常性性。仪器的检检定则按按检定或或自校作作业指导导书进行行。仪器的使使用登记记、校准准计划、、校准记记录等文文件存档档。仪器专人人使用，，操作者者应持证证上岗。。五、仪器器设备的的功能监监测高压灭菌菌器：定定期监测测（每月月一次））生物指示示剂：嗜嗜热脂肪肪芽孢杆杆菌化学指示示剂：变变色的指指示带培养箱、、冰箱、、水浴箱箱：每日早、、晚两次次温度观观测，绘绘制温度度曲线图图五、仪器器设备的的功能监监测厌氧培养养装置：：化学标记记：美美蓝蓝生物学指指标：铜铜绿假单单胞菌CO2培养箱：：每天检查查箱内的的CO2含量五、仪器器设备的的功能监监测生物安全全柜：定期更换换滤网，，紫外线线每3月检查1次微生物鉴鉴定仪及时更新新软件每批号鉴鉴定卡用用标准菌菌株测定定五、仪器器设备的的功能监监测表1仪器设备备的质量量控制标标准设备

控制标准

允许范围高压灭菌器121℃

≥121℃培养箱

35℃

±1℃水浴箱

37℃

±0.5℃冰箱

4℃

±2℃低温冰箱-20℃

±5℃CO2培养箱5%~10%

<10%培养基的的有效性性试验每一批新新制或新新购的培培养基，，使用前前均须取取标准菌菌株试验验.培养基的的试验结结果需要要加以记记录，项项目包括括试验日日期、试试验结果果以及实实验者的的签名等等。六、培养养基质量量控制培养基质质量控制制培养基的的量：平板培养养基的厚厚度一般般为3mm(90mm平皿+15--20ml培养基））斜面不超超过试管管的2/3常用培养养基的质质量控制制（一）检验项目目与方法法：物理、、化学及及生物学学指标鉴鉴定A：感官测定定，检查查其颜色色与透明明度，培培养基应应澄清，，无浑浊浊。B：PH测定，按按各种培培养基要要求的PH±0.2。C：生物学指指标检定定，无菌菌实验、、被检培培养基相相应细菌菌生长率率测试；；菌落大大小及特特征的检检测。常用培养养基的质质量控制制（一）无菌试验验：每批配好好的培养养基须进进行无菌菌试验随机选取取5%-10%的量，如如果配制制大量的的培养基基，则任任意选取取10个平板或或管装培培养基，，35℃温度下过过夜培养养，证明明无菌生生长为合合格常用培养养基的质质量控制制（二）生长率测测试：适用于液液体和固固体培养养基：将将菌培养养液，用用生理盐盐水做倍倍比稀释释，取合合适稀释释度进行行平板计计数，同同时以新新鲜配制制的国标标培养基基进行对对照。常用培养养基的质质量控制制（三）菌落大小小测试：：划线分离离测试菌菌，取10个菌菌落测量量直径大大小，其其直径均均值与新新鲜配制制的国标标培养基基无统计计学差异异。常用培养养基检定定用标准准菌株表2常用培养养基的质质量控制制培养基质控菌种生长情况结果血琼脂

巧克力琼脂营养琼脂麦康凯琼脂

中国蓝琼脂

SS琼脂

沙保罗琼脂

化脓链球菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌福氏志贺菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌福氏志贺菌金黄色葡萄球菌产气肠杆菌鼠伤寒沙门菌大肠埃希菌白色假丝酵母菌++++++-++-++-+明显乙型溶血环甲型溶血环24h生长生长分解乳糖，菌落红色不分解乳糖，菌落无色透明不生长分解乳糖，菌落蓝色不分解乳糖，菌落无色不生长粉红色菌落无色菌落，中心黑色

常用培养养基检定定用标准准菌株表2常用培养养基的质质量控制制生长生长，溶血生长部分抑制生长，黄色菌落生长，蓝绿色菌落大量生长抑制生长++++++-脆弱拟杆菌产气荚膜梭菌菌空肠弯曲菌大肠埃希菌霍乱弧菌副溶血弧菌霍乱弧菌大肠埃希菌厌氧血平板

弯曲菌琼脂TCBS琼脂碱性蛋白胨水

结果生长情况质控菌种培养基培养基保保存环境境制成的培培养基保保存环境境为4℃℃冰箱，，如制成成平板则则用塑料料袋包装装置冰箱箱保存，，干燥培养养基干粉粉含有活活性物质质或遇热热易分解解的物质质应仔细细查看存存放条件件，多数数也须放放在2--8℃℃条件保保存。含有高浓浓度胆盐盐的培养养基存放放于10-15℃。。培养基配配制的质质量控制制培养基的的制作过过程必须须统一培养基或或添加剂剂的剂量量、pH值、高温温灭菌的的时间或或温度，，都需遵遵照规定定培养基名名称、本本批配制制量、配配方、配配制日期期和配制制人员姓姓名都必必须详细细记录

培养基制制备控制制程序培养基配配制所用用的仪器器设备必必须经过过相应的的鉴定。。配制培养养基所用用的用具具及容器器必须是是清洁或或是灭菌菌的。培养基的的配制程程序（一一）不同的培培养基配配制时注注意各类类成分的的用途。。对于干燥燥培养基基配制，，同样需需要进行行PH测验。培养基的的配制程程序（二二）配制好的的培养基基（尤其其是糖发发酵管））不宜久久放。因因为培养养基吸收收空气中中的二氧氧化碳，，会使培培养基变变酸，从从而影响响细菌的的生长。。培养基中中的抑制制剂及指指示剂一一定要精精确称量量。七、试剂剂、染色色液及抗抗血清的的质控染色液的的质量控控制染色液要要标明配配制或购购入日期期，选用用适当的的标准菌菌株作阳阳性及阴阴性对照照鉴定。。革兰氏染染色用金金黄色葡葡萄球菌菌和大肠肠埃希菌菌制备浓浓菌悬液液进行质质量控制制，每次次质控与与标本检检测同步步进行。。七、试剂剂、染色色液及抗抗血清的的质控各种染色色液的监监控菌株株染色液阳阳性对照照菌阴阴性对对照菌监监控频频度革兰染色色液金金黄色葡葡萄球菌菌大大肠埃埃希菌每每天抗酸染色色液结结核分枝枝杆菌每每次异染颗粒粒染色液液白白喉喉棒状杆杆菌每每次次荚膜染色色液肺肺炎克克雷伯菌菌每每批鞭毛染色色液普普通变变形杆菌菌福福氏氏志贺菌菌每每次次七、试剂剂、染色色液及抗抗血清的的质控试剂的质质量控制制各类试剂剂，在配配制或购购入后均均应进行行“有效效”试验验，用已已知阳性性及阴性性菌株进进行试验验试剂须根根据标示示配制，，适当储储存对较稳定定的试剂剂如靛基基质试剂剂应在配配制时及及每周予予以检测测，凡不不稳定的的试剂每每天使用用时均应应检测，，合格后后才能使使用七、试剂剂、染色色液及抗抗血清的的质控表3常用试剂剂的阳性性、阴性性对照菌菌株常用试剂阳性对照菌株阴性对照菌株凝固酶试剂金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌触酶试验用试剂化脓链球菌V-P试验用试剂阴沟肠杆菌大肠埃希菌大肠埃希菌阴沟肠杆菌氧化酶试剂铜绿假单胞菌大肠埃希菌

靛基质试试剂金黄色葡葡萄球菌菌七、试剂剂、染色色液及抗抗血清的的质控诊断血清清的质量量控制购入的沙沙门菌属属、志贺贺菌属、、致病性性大肠杆杆菌的诊诊断血清清必须立立即记录录其购入入日期、、观察透透明度、、色彩有有无变化化和是否否有沉淀淀物，然然后置4℃冰箱保存存使用前应应注意检检查诊断断血清的的批号、、有效期期，如发发现浑浊浊或有絮絮状沉淀淀物时，，很可能能系污染染所致，，不能再再继续使使用七、试剂剂、染色色液及抗抗血清的的质控诊断血清清的质量量控制使用前应应以阳性性及阴性性菌株进进行检测测，观察察其效价价及特异异性不得将诊诊断血清清置室温温保存,各种诊断断血清均均应置冰冰箱中4℃保存每月用标标准菌株株进行一一次测定定八、检验验过程的的质量控控制检测质量量保证定期使用用有证标标准物质质和次级级标准物物质（参参考物质质）进行行内部质质量控制制。参加实验验室间的的比对或或能力验验证利用相同同或不同同方法进进行重复复检测对留存的的样品进进行再检检测。重复计数数要求菌落计数数精密度度控制直直接计数数，选择择同一标标本，要要求检验验人员进进行菌落落计数。。自身同一一平皿重重复计数数误差应应小于7.7%%实验人员员之间同同一平皿皿重复计计数误差差±18.2%自身同一一梯度平平行加样样两皿间间相对误误差小于于7.7%实验人员员之间同同一梯度度计数误误差±18..2%%不同梯度度间菌落落计数最最终误差差小于7.7%%菌种鉴定定质控菌种鉴定定质控要要求，对对所给的的微生物物菌种，，按有关关的方法法及指标标进行生生化、血血清等方方面的鉴鉴定。鉴定质量量评价：：鉴定程程序是否否正确；；鉴定方方法是否否正确；；具体操操作技术术是否熟熟练，结结果报告告是否正正确。内部质量量控制的的推荐频频率菌落计数数精密度度控制：：1次次/3月月；菌种鉴定定控制：：1次次/半年年或1年年九、标准准菌株的的来源和和保存标准菌株株要求必须是形形态、染染色反应应、生理理生化及及血清学学特性典典型而稳稳定的菌菌株实验结果果重复性性好，极极少发生生变异国际社会会认可来源于专专门机构构九、标准准菌株的的来源和和保存标准菌株株来源美国典型型菌种保保藏中心心ATCC卫生部药药品生物物制品检检定所菌菌种保藏藏中心国家医学学微生物物菌种保保藏中心心九、标准准菌株的的来源和和保存标准菌株株的保存存方法冷冻干燥燥法：最理想的的保存方方法，不不改变菌菌种性状状，保存存时间长长手续繁琐琐，需专专门的冷冷冻干燥燥设备菌种保存存中心均均采用此此法九、标准准菌株的的来源和和保存标准菌株株的保存存方法冰冻保存存法：此法较简简单，将将细菌混混悬于脱脱纤维羊羊血或脱脱脂牛奶奶中，置置液氮或或-20℃℃冰箱保存存但细菌经经多次转转种，性性状可能能发生变变异九、标准准菌株的的来源和和保存标准菌株株的保存存方法培养基保保存法：：最简易易方便的的方法，，适用于于大多数数实验室