科研课题申请书讲课稿

科研课题申请书课题项目:申请人:学号:单位:专业申请时间:2014年 12 月推测其可能为一新的肿瘤克制基因。申请人首次证实基因在脑胶质母细胞瘤C6细胞中的肿瘤克制基因功能，并且揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究基因失活与肝癌细胞的增殖及侵袭本中研究基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明确在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化药物是否能重新诱导关键词：T-caherin；肿瘤克制基因；肝癌（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据,,进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶药物及判断预后，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。Caherin超家族(1,2,3,4)CaherinE-caherinN-caherin由细胞外钙接合因缺失经典Caherin分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上故而命名trut-rin（即-rin，又称CH13或H-rin。Caherin分子的深入研究发现，E-，N-caherin分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6，7，8910。将E-rin分子重新导入缺失E-caherin1。近年已开始有-rin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、1，1516171，推测-rin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤克制基因角色但尚无人关于其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制2003（黄志勇基因导入缺失表达分子的大鼠脑胶质母细胞瘤C6细胞使其过度表达-rinC6首次证实在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤克制基因功能，并且进一步揭示其克制机制是分子经过诱导P21G2期阻滞。该文发表于olulrCllulrBioloy200323:566-57（1这一研究发现为20，2，2，23。-rin基因在乳基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺失13162-rin基因位于染色体162，肝癌的发生16q24(25)Riou（2002）16q24的13个往往在肝癌中缺失表达mRNA在PLC/PRF/C,TONGHA22TNGH四种肝癌细胞株中缺失表达，但-rin基因本身并且未发生缺失突变（1。u（200）进一步研究显示基因启动子在肝癌中高度甲基化，而E-caherinCaherin基因启动子甲基化在肝癌中具有高度特异性且基因启动子甲基化与-rin基因失活密切相关（2。这些研究表明-rin2ug/ml去甲基化药物5-aza-2’-eoxycytiine共孵6天能使皮肤鳞癌细胞株恢复-rin分子表达（1。但目前关于T-caherin基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导分子在肝癌细胞株中重新表达，并且克制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。本研究将进一步研究在肝癌中的基因功能，调查缺是否能克制肝基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示基因失活与基因与C6细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。主要参考文献：B,MarcozziCsuperfamily:iversityinformanfunction.JCell2001,114:629-641KemlerR.ClassicCellBiol.,1992,3:149-155KollerE,B.ifferentialtargetingofN-caherininpolarizeepithelialcells.JBiolChem.,1996,271:30061-30067cellahesion receptorasamorphogeneticregulator.Science1991,251:1451-1455B..,Marcozzi,iversityinfromanfunction.J.Cell2001,114:629-641Berx,VanF..E-caherin/catenin complex: animportant tumorigenesis progression.BreastRes.2001,3::289-293.Bremnes,R.R.,Gabrielson,E.etal.High-throughputtissuemicroarrayusetoevaluatebiologyprognosticsignificanceoftheE-caherininnon-small-celllungJ.Clin.Oncol.2002,20:2417-2428.CaniusB.,etal.Tumour-associateE-caherin mutations alter cellular morphology, cellularahesionincreasecellularmotility.1999,18:4301-4312.Kam et al.p27 isinvolve contactinhibitionofcellgrowth1999,18::869-876.expression ofE-caherin in hepatocellular carcinoma :correlationwithgeneticalteration,beta-catenin expression, clinical features.Hepatology2002,36:692-701K.,VJr.etal.GeneticmanipulationofE-caherinexpressionepithelialtumorcellsrevealsaninvasionsuppressorrole.Cell1991,66::107-119.RiouP,SaffroyR,ComoyJ,etal.Investigationinlivertissuescelllinesofthetranscriptionof13tothe16q24 thatarefrequentlyeleteinhepatocellularcarcinoma.ClinRes.2002Oct;8(10):3178-86.Sato,Mori,Y.,etal.H-caherin(CH13)geneisinactivateinhumanlungHum1998,103:96-101anovelwithgrowthinhibitoryfunctionsiminisheexpressioninhumanNat.1996,2:776-782elgao,Gomez,J.,etal.LossofH-caherinproteinexpressioninhumannon-smallcelllungcancerisassociatewithtumorigenicity.Clin.CancerRes22、项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题一、研究T-caherin在肝癌中的基因功能将基因导入缺失表达的肝癌细胞株HepG2分子的肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化，证实是否学特征。HepG2的HepG2细胞于皮下接种裸鼠，在裸鼠肝癌模型上进一步证实基因的肿瘤克制基因功能。在肝癌细胞株存在与在C6细胞中一致的分子机制，分子经过诱导表达致使肝癌细胞于G2期阻滞。二、在临床切除的肝癌标本中研究分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，在人肝癌中揭示基因失活与肝癌的恶性生物学特征及预后的关系。研究50例临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织中 的表达揭示基因表达水（失活与肝癌恶性分化程度肝内转移（囊括合并且门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。及2年内未复发或肝外转移的肝癌病历的石蜡标本各20（失活与肝癌复发和转移的关系。三、在肝癌细胞株和裸鼠肝癌种植模型上证实去甲基化药物5-aza-2’33、拟采取的研究方案及可行性分析构建↓lipofectin为载体转染肝癌细胞系HepG2细胞↓G418筛选表达分子的阳性克隆↓blot鉴定转染后蛋白表达↓比较表达的阳性克隆与不表达征:细胞增殖计数3H标胸腺嘧啶摄取率测定克隆增殖试验细胞粘试验细胞云集试验的生物学特征107T-caherin（+）或（-）的肝癌细胞（20只）裸鼠的生存期研究基因在肝癌中肿瘤克制功能的分子机制流式细胞仪检测表达周期变化blotp53,p21,p27,cyclin的表达变化研究是否分子在肝癌中同样存在诱导P21G2期阻滞的分子机制。二、研究T-caherin基因失活与临床肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系的技术路线50例a.PCR；免疫组织化学；Westernblot缺失表达（基因失活）与人肝癌发生的关系。c.表达水平与肿瘤病理分级、肝内转移（囊括合并且门静脉癌栓和卫星灶形成）关系。大小在2~5cm之间、无肝内外转移、行根治性切除后采用同样的治220例回顾研究表达水平与肿瘤复发和转移的关系三、研究去甲基化药物诱导表达及其治疗学意义的技术路线。1.研究表明在肝癌细胞株HepG2,PLC/PRF/C,和HA22TNGH 中缺失。采用Herman 已报导的检启动子甲基化和非甲基序列的引物，进一步证实列引物，上游5’-’，下游5-GACGTTTTCATTCATACGCG-3’，扩增非甲化序列引物，上游-3’，下游5’’。采用blot进一步证实在上述存在的启动子甲基化肝癌细胞株中蛋白水平表达缺失。2.选择启动子高度甲基化的细胞株与去甲基化药物5-aza-2’作用6天后，采用blot检测蛋白水平表达;采用细胞增殖计数、3H标胸腺嘧啶摄取率测定、克隆增殖试验、细胞粘附试验和细胞云集试验检测表达前后肝癌细胞的增殖侵袭及转移等恶性生物学特征的变化将启动子高度甲基化的细胞株（细胞数1x107）诀别接种60只裸鼠后随机分成两（每组30只治疗组再分成五（每组6只每组诀别按0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug/克体重每日皮下注射5-aza-2’ ，共注射一周，关于照组仅注射生理盐水，观察不同组裸鼠的肿瘤生长速度、肿瘤转移发生的时间、累及器官及频率及裸鼠的生存期。4、项目的特色及创新之处中表达显著下降、缺失的报导，推测分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤克制基因角色。申请人（黄志勇）最新研究首次证实在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤克制基因功能并且首次揭示其肿瘤克制功能的分子机制（Huang等，MolecularCllulrBioloy200323:566-57。但目前尚无人关于-rin在肝癌中的基因功能及其分子机制进行研究鉴于申请人前期世界领先的研究工作基础，该研究将进一步揭示分子在肝癌中的基因功能和其分子机制，具有世界先进性和独创性。Caher