荧光显微镜的基本原理及应用课件

1、高分辨率荧光显微镜的基本原理和操作要求一、荧光显微镜(fluorescence microscope) 原理： 某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。The optical system of a fluor

2、escence microscope.A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2) (7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件：“O”为观察透射光时用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如FITC)；“WG为观察红色荧光时用(如TRITC)。 (8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)。 (9)通过粗、细螺旋调整焦距。 (10)打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统软件，采集数码图像。四、荧光

3、显微镜标本制作要求（一）载玻片载玻片厚度应在0.81.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。（三）标本组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。（四）封裱剂封裱剂常用甘油，必须

4、无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。六、荧光组化实验中应注意的几个问题1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。3、在荧光观察中，常因激

5、发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。七、荧光显微镜应用技术1. 对细胞结构或组分的定性位、半定量研究 免疫荧光技术 用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技术(d

6、irect immunofluorescent technique)”。用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescent technique)”。 1.分子标记 利用绿色荧光的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察2.药物筛选 荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针 八、使用注意事项1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。2 荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射标本。3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动