分子生物学第三章核酸的结构与功能课件

1、第二章核酸的结构与功能Structure and Function of Nucleic Acid核酸的发现和研究工作进展 1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985年 Mullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动2001年 美、英等国完成

2、人类基因组计划基本框架核 酸(nucleic acid) 是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸RNA（Ribonucleic acid) 核糖核酸 核酸分类和分布 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）:遗传信息的贮存和携带者，生物的主要遗传物质。在真核细胞中，DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中均有各自的DNA。原核细胞没有明显的细胞核结构，DNA存在于称为类核的结构区。每个原核细胞只有一个染色体，每个染色体含一个双链环状DNA。 核糖核酸（ribonucleic aci

3、d, RNA）：主要参与遗传信息的传递和表达过程，细胞内的RNA主要存在于细胞质中，少量存在于细胞核中，病毒中RNA本身就是遗传信息的储存者。另外在植物中还发现了一类比病毒还小得多的侵染性致病因子称为类病毒，它是不含蛋白质的游离的RNA分子，还发现有些RNA具生物催化作用（ribozyme）。第一节核酸的化学组成及一级结构The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acid核酸(DNA和RNA)核苷酸核苷和脱氧核苷磷酸戊糖碱基嘌呤嘧啶核糖脱氧核糖核酸组成 分子组成碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱戊糖(ribose)：核糖，脱氧

4、核糖磷酸(phosphate)核苷酸是构成核酸的基本组成单位DNA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸 。RNA的基本组成单位是核糖核苷酸 。（二）戊糖（构成RNA）12345核糖(ribose)（构成DNA）脱氧核糖(deoxyribose)H脱氧核苷嘌呤N-9 或嘧啶N-1与脱氧核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成脱氧核苷(deoxyribonucleoside)。（三）核苷(ribonucleoside) 嘌呤N-9或嘧啶N-1与核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成核苷(ribonucleoside)。核苷NNNN9NH2OOHOHHHHCH2OHH12糖苷键核 苷 酸 的 结 构 左 边 是 电

5、 脑 模 型 ， 右 边 是 简 化 的 表 示 法酯键糖苷键多磷酸核苷酸环化核苷酸：cAMP、cGMP，是细胞信号转导中的第二信使。cAMP核苷酸衍生物许多单核苷酸在体内具有许多重要的生理功ATP是体内能量的直接来源和利用形式。 腺苷酸是NAD、FAD、辅酶A等的组成成分。 cAMP与cGMP是细胞内信号转导过程中重要的调节因子。二、DNA是脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成的大分子一个脱氧核苷酸3的羟基与另一个核苷酸5的-磷酸基团缩合形成磷酸二酯键(phosphodiester bond)。 多个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键构成了具有方向性的线性分子，称为多聚脱氧核苷酸(polydeox

6、ynucleotide)，即DNA链。5-末端3-末端CGA磷酸二酯键磷酸二酯键交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 (backbone)。DNA链的方向：5 3三、RNA也是具有3,5-磷酸二酯键的线性大分子RNA也是多个核苷酸分子通过酯化反应形成的线性大分子，并且具有方向性；RNA的戊糖是核糖；RNA的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。5端3端CGA四、核酸的一级结构是核苷酸的排列顺序A G P5 P T PG PC PT P OH 3 书写方法：5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3D

7、NA的空间结构又分为二级结构(secondary structure)和高级结构。DNA的空间结构(spatial structure)构成DNA的所有原子在三维空间具有确定的相对位置关系。一、DNA的二级结构是双螺旋结构不同生物种属的DNA的碱基组成不同同一个体的不同器官或组织的DNA碱基组成相同。A = T，G = CChargaff 规则（一）DNA双螺旋结构的研究背景获得了高质量的DNA分子的X射线衍射照片。提出了DNA分子双螺旋结构(double helix)模型。AGCTA/TG/CG+C嘌呤/嘧啶大肠杆菌26.024.925.223.91.090.9950.11.04结核杆菌15

8、.134.935.414.61.030.9970.31.00酵母31.718.317.432.60.971.0535.71.00牛29.021.221.228.71.011.0042.41.01猪29.820.720.729.11.021.0041.41.01人30.419.919.930.11.011.0039.81.01不同生物来源DNA碱基组分和相对比例（二） DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major gr

9、oove)及小沟(minor groove)相间。碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; GC） 。相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。亲水性的骨架位于双链的外侧。 疏水性的碱基位于双链的内侧。骨架与碱基碱基互补配对:提供双螺旋横向力量鸟嘌呤/胞嘧啶碱基互补配对: 腺嘌呤/胸腺嘧啶3,41,6碱基堆积作用力：提供双螺旋纵向力量(三)DNA双螺旋结构的多样性、可变性DNA双螺旋的不同构象三种DNA双螺旋构象比较A B Z外型 粗短 适中

10、 细长螺旋方向 右手 右手 左手螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm碱基直升 0.23nm 0.34nm 0.38nm碱基夹角 32.70 34.60 60.00每圈碱基数 11 10.4 12轴心与碱基对关系2.46nm 3.32nm 4.56nm碱基倾角 190 10 90糖苷键构象 反式 反式 C、T反式，G顺式大沟 很窄很深 很宽较深 平坦小沟 很宽、浅 窄、深 较窄很深（四）DNA的多链螺旋结构在酸性的溶液中，胞嘧啶的N-3原子被质子化，可与鸟嘌呤的N-7原子形成氢键；同时，胞嘧啶的N-4的氢原子也可与鸟嘌呤的O-6形成氢键，这种氢键被称为Hoogsteen氢键。 Ho

11、ogsteen氢键Hoogsteen氢键，不破坏Watson-Crick氢键，由此形成了CGC的三链结构(triplex)。DNA分子内的三链结构 多聚嘌呤多聚嘧啶DNA分子间的三链结构DNA三链间的碱基配对T-A-TC-G-C三链结构鸟嘌呤之间通过Hoogsteen氢键形成特殊的四链结构(tetraplex)。四链结构真核生物DNA3-末端是富含GT的多次重复序列，因而自身形成了折叠的四链结构。二、DNA的高级结构是超螺旋结构超螺旋结构(superhelix 或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。 正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方

12、同相同。 负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。 螺旋和超螺旋电话线螺旋超螺旋（一）原核生物DNA的环状超螺旋结构原核生物DNA多为环状，以负超螺旋的形式存在，平均每200碱基就有一个超螺旋形成。L=25,T=25,W=0松弛环形1152010523L=23,T=23,W=0解链环形15101520231510152025L=23,T=25,W=2负超螺旋121482316131510152023右手旋转拧松两匝后的线形DNADNA超螺旋的形成超螺旋的拓扑学公式：L=T+W或=+DNA超螺旋结构的电镜图象（二）真核生物DNA的高度有序和高度致密的结构真

13、核生物DNA以高度有序和高度致密的形式存在于细胞核内。在细胞周期的大部分时间里，DNA以松散的染色质(chromatin)形式分布于细胞核（常染色质，异染色质）在细胞分裂期，则形成高度致密的染色体(chromosome)。 染色体的基本结构为核小体真核生物中DNA的三级结构与蛋白质有关。和DNA结合的蛋白质有组蛋白和非组蛋白。组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个分子8个亚基形成八聚体（组蛋白核心），DNA双链螺旋绕在八聚体上，被1.8圈140-145碱基对的DNA所围绕。核心颗粒。H1位于核小体之间的连接区，组成串珠状结构，60-65碱基对。DNA：约200bp 组蛋白：H1H2A，H2BH

14、3H4核小体的组成组蛋白与DNA的结合核小体核小体的构成核心颗粒 连接区 核心组蛋白：组蛋白八聚体H2A、H2B、H3 、H4各2分子DNA双螺旋分子(140bp)在核心组蛋白缠绕 1.75圈DNA（60bp） 组蛋白H1 连接核心颗粒 DNA在真核生物细胞核内的组装:核小体串珠样的结构DNA染色质呈现出的串珠样结构。DNA染色质的电镜图像双链DNA的折叠和组装DNA经过多次折叠，被压缩了800010000倍，组装在直径只有为数微米的细胞核内。核小体的折叠及染色体组装2nm11nm30nm300nm1400nm700nm逐级盘曲折叠真核生物染色体DNA组装不同层次的结构DNA （2nm）核小体

15、链（ 11nm，每个核小体200bp）纤丝（ 30nm，每圈6个核小体）突环（ 150nm，每个突环大约75000bp）玫瑰花结（ 300nm ，6个突环）螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花）染色体（ 1400nm， 每个染色体含10个玫瑰花200bp）真核生物的染色体DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基因Gene: 从结构上定义是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸序列决定了该基因表达产物的特性，决定了基因的功能。 三、DNA是遗传信息的物质基础基因组Genome: 细胞中全部遗传信息，包含DNA

16、全部序列及其表达。第三节 RNA的结构与功能Structure and Function of RNARNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。RNA分子较小，核苷酸数目变异多，70-几千个，人的DNA 280万kb。RNA总量多于DNA，其种类、大小和结构远比DNA表现出多样性。哺乳细胞RNA 10pg，而DNA至多6.38 pg，RNA的种类、分布、功能信使RNA(messenger RNA, mRNA)是合成蛋白质的模板。 不均一核RNA(hnRNA) 经过剪切后成为成熟的mRNA。 hnRNA含有内含子(intron

17、)和外显子(exon)。 外显子是氨基酸的编码序列，而内含子是非编码序列。 mRNA依照自身的碱基顺序指导蛋白质氨基酸顺序的合成。一、mRNA是蛋白质合成中的模板* mRNA结构特点1. 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。2. 大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。* mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。DNAmRNA蛋白转录翻译原核细胞 细胞质细胞核DNA内含子外显子转录转录后剪接

18、转运mRNAhnRNA翻译蛋白真核细胞 hnRNA 内含子(intron)mRNA mRNA成熟过程 外显子(exon)从AUG 开始，每三个核苷酸为一组编码了一个氨基酸，称为三联体密码(codon)。成熟的mRNA由氨基酸编码区和非编码区构成。 5-末端的帽子(cap)结构和3-末端的多聚A尾(poly-A tail)结构。 成熟的真核生物mRNA帽子结构帽子结构:m7GpppNm（一）大部分真核细胞mRNA的5末端都以7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷为起始结构 mRNA的帽结构可以与帽结合蛋白(cap binding protein，CBP)结合。 加帽过程帽子结构的功能 ：由于甲基化，保护mR

19、NA不被核酸外切酶水解。与核糖体识别，参与翻译起始相关mRNA的帽结构可以与帽结合蛋白(cap binding protein，CBP)结合。这种复合物对于mRNA从细胞核向细胞质的转运与核蛋白体的结合，与翻译起始因子的结合以及mRNA 稳定性均有重要作用。真核生物的mRNA 的3-末端转录后加上的一段长短不一（80-250）的核苷酸聚合区。（二）在真核生物mRNA的3末端有多聚腺苷酸结构 (Poly A tail)PolyA与mRNA的表达与稳定有重要关系。加尾过程稳定mRNAThe poly(A)与蛋白质相结合（PABP） The poly(A) 的每10-20碱基1个PABP单体。多聚A

20、尾的功能 ：mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控 帽子结构和多聚A尾的功能转运RNA(transfer RNA, tRNA)在蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体, 将氨基酸转呈给mRNA。由7495核苷酸组成；占细胞总RNA的15%；具有很好的稳定性。二、tRNA是蛋白质合成中的氨基酸载体（一）tRNA中含有多种稀有碱基tRNA具有局部的茎环(stem-loop)结构或发卡(hairpin)结构。（二）tRNA具有茎环结构tRNA的二级结构三叶草形氨基酸臂DHU环反密码环TC环附加叉tRNA的倒L三级结构tRNA的三级结构的稳定力是核苷酸之间的各种氢键。tRNA的3-末

21、端都是以CCA-OH结尾。3-末端的A与氨基酸共价连结，tRNA成为了氨基酸的载体。不同的tRNA可以结合不同的氨基酸。 （三）tRNA的3-末端连接氨基酸tRNA的反密码子环上有一个由三个核苷酸构成的反密码子(anticodon)。tRNA上的反密码子依照碱基互补的原则识别mRNA上的密码子。（四）tRNA的反密码子识别mRNA的密码子核蛋白体RNA(ribosomal RNA，rRNA)是细胞内含量最多的RNA(80)。rRNA与核蛋白体蛋白结合组成核蛋白体(ribosome)，为蛋白质的合成提供场所。三、以rRNA为组分的核蛋白体是蛋白质合成的场所 rRNA的分子结构特征：单链，螺旋化程

22、度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能5sRNA的二级结构核蛋白体的组成原核生物（以大肠杆菌为例）真核生物（以小鼠肝为例）小亚基30S40SrRNA16S1542个核苷酸18S1874个核苷酸蛋白质21种占总重量的40%33种占总重量的50%大亚基50S60SrRNA23S5S2940个核苷酸120个核苷酸28S5.85S5S4718个核苷酸160个核苷酸120个核苷酸蛋白质31种占总重量的30%49种占总重量的35% rRNA 分子大小不均一，真核细胞的rRNA有4种，其沉降系数分别为28S、58S、5S和18S。大约与70种蛋白质结合而存在于的核蛋白体的大小亚基中。rRNA的二

23、级结构为茎环样结构。18S rRNA的二级结构蛋白质合成时形成的复合体RNA组学是研究细胞内snmRNA的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时空状态下snmRNAs表达谱的变化，以及与功能之间的关系。 四、其他非编码RNA参与基因表达的调控细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 ncRNAs核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA小片段干涉 RNA 参与hnRNA的加工剪接snmRNAs的种类snmRNAs的功能siRNA是生物宿主对外源侵入的基因表达的

24、双链RNA进行切割所产生的特定长度和特定核酸序列的小片段RNA。siRNA可以与外源基因表达的mRNA相结合，并诱发这些mRNA的降解。 基于此机理，人们发明了RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术。小片段干扰RNA原核生物基因表达的特异性五、核酸在真核细胞和原核细胞中表现了不同的时空特性真核生物基因表达的特异性局部双链tRNArRNAmRNA三叶草形、倒L形含稀有碱基多反密码子CCAOH 3呈花状5m7GpppNm、3 polyA编码序列单链局部双链结构蛋白质合成的模板搬运活化的aa到核糖体组成核蛋白体分子大小不一,量 80%,稳定三种RNA内容小结功能核酸的理化性质T

25、he Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid第四节核酸的酸碱及溶解度性质核酸为多元酸，具有较强的酸性。核酸的高分子性质粘度：DNARNA dsDNA ssDNA沉降行为:不同构象的核酸分子的沉降的速率有很大差异，这是超速离心法提取和纯化核酸的理论基础。酸性化合物 两性解离，但酸性强 电泳行为泳向正极（pH7-8） 二、高分子性质 粘度 DNARNA 超离心沉降 凝胶过滤 分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、碱基对数目（bp）、离心沉降常数（S） 沉淀行为加盐（中和电荷）；乙醇核酸在波长 260nm 处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决

26、定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。一、核酸分子具有强烈的紫外吸收碱基的紫外吸收光谱DNA或RNA的定量A260 = 1.0 相当于 50g/ml 双链DNA(dsDNA)40g/ml 单链DNA (ssDNA or RNA)20g/ml 寡核苷酸确定样品中核酸的纯度 纯 DNA: A260/A280 = 1.8纯 RNA: A260/A280 = 2.0紫外吸收的应用二、DNA变性是双链解离为单链的过程在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。定义DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。变性的因素： 如过量的酸、碱；加热，热变性；尿素变性；甲醛使RNA变性。协同性的DNA解链高温或极端的pHDNA的变性部分变性DNA的电镜图像增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。DNA解链时的紫外吸收变化DNA的解链曲线连续加热DNA的过程中以温度相对于A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。 解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度。解链温度(melting temperature，Tm)G+C 含量越高，解链温度就越高。解链曲线的变化三、变性的核酸可以复性或形成杂交双链当变