电镜三维重构II课件

1、内容数学工具透射电镜高分辨电子显微镜的成像原理高分辨电子显微镜的图像处理电镜三维重构的原理电镜三维重构的应用电镜三维重构简介为什么用电镜三维重构？研究对象电镜三维重构主要方法常用软件电镜三维重构的原理中心截面定理（富立叶空间）Randon定理（实空间）为什么用电镜三维重构？X-rayEM NMR中子衍射蛋白质晶体学结晶：mm（一般光源）；0.02 mm（同步辐射光源）相位问题：同晶置换、分子置换、直接法、多波长反常散射、同晶差值傅里叶法等样品的分子体积太大（7.5 nm），衍射点可能重叠特点：分辨率高，是目前常用的方法（PDB中80%的结构由X-ray测定）蛋白质分辨率年方法Bacterial

2、 reaction center (PS)2.8 1985X-rayBacteriorhodopsin (protein pump)3.5 1990EMBacterial porin1.8 1992X-rayProstaglandin synthase3.5 1994X-rayPlant light-harvesting complex (PS)3.4 1994EMBacterial antenna complex LH2 (PS)2.5 1995X-rayMitchondrial & Bacterial cytochrome oxidase2.8 1995X-rayCHIP28 (aquap

3、orin)3.5 EMMicrosomal glutahion transferase3.5 EMComplex I (mitochondrial a transport)25 1987EMPhotosystem II reaction centre (PS)17 (pr.)1993EMCalcium ATPase (ion pump)14 1993EMAcetylcholine receptor (ion channel)9 1993EMPhotosystem I reaction centre (PS)6 1993X-rayBand 3 (anion exchanger)20 1994EM

4、Bacterial antenna complex LH1 (PS)8.5 (pr.)1995EMProton ATPase10 (pr.)1995EMVirsual rhodopsin7 1995EMNa, K-ATPase15 1995EMEM电子辐射导致样品损伤分辨率很低数据处理复杂二维晶体的生长特点：对于单颗样品不需结晶，能够测定低分辨率的结构；对于不能生长三维晶体，但可以获得二维晶体的样品，微米量级的晶体可用于结构分析；分子量不受限；分析生物大分子复合物结构具有一定优势；也是研究细胞器和亚细胞器的重要工具。研究对象二维晶体螺旋结构二十面体对称性单颗非对称单颗螺旋结构螺旋结构(Vito

5、ld E. G.et al, PNAS, 2005)(Nogales et al, Cell, 1999)螺旋结构(Vanloock M. S. et al, J. Mol. Biol. 2003)(Yang S. X. et al, J. Mol. Biol., 2001)(Yang S. X. et al, J. Mol. Biol., 2001)(Haruta N. et al, J. Biol. Chem., 2003)二十面体二十面体PBCV-1PolyomaHSVRotavirus对称性单颗(Yang S. X. et al, J. Mol. Biol., 2001)(Yang S

6、. X. et al, J. Mol. Biol., 2002)(Chen Y. J. et al, J. Mol. Biol., 2001)非对称单颗电镜三维重构主要方法蛋白质电子晶体学（二维晶体）螺旋重构二十面体重构单颗粒重构Electron Tomography常用软件二维晶体MRC-LMB 2D PackageSPECTRA (NCMI)螺旋结构MRC-LMB Helical PackageZephyr (Brandeis)Phoelix (Research Scripps)二十面体重构EMANEMBL Isosahedral PackagePurdue Virus Package单颗

7、SPIDEREMANIMAGICTomographyIMOD单张像与三维结构的关系单张像与三维结构的关系投影FT截面FT(x,y,z)p(x,y)F(h,k,l)Fp(h,k)电镜三维重构的示意图（2D）电镜三维重构的示意图（3D）Randon定理（反投影back-projection)R结构象花儿一样电镜三维重构的应用电镜三维重构的基本步骤样品制备单颗粒重构入门应用实例电镜三维重构的基本步骤电镜三维重构的基本步骤分离、纯化（包括蛋白质二维晶体的生长）电镜样品的制备高分辨电子显微像的拍摄样品的多角度照相低剂量曝光技术 (Low-Dose)：聚焦和照相不在同一个样品区域低温电镜技术：电镜中样品的

8、温度维持在-160左右像的数字化数据处理及计算机三维重构三维结构的解释（构建原子模型）样品制备负染糖包埋单宁酸（Tannic Acid）包埋冰包埋负染原理及方法：用高电子密度的染色剂沉积在蛋白质分子周围，使蛋白质的电子显微像具有较高的反差（衬度）。常用的负染剂：0.5 % 5 % 醋酸铀特点：衬度好；样品容易准备；分辨率低，1520 ；样品缩小，垂直铜网方向样品变扁平；样品脱水影响蛋白质分子的结构负染糖包埋葡萄糖与蛋白质所处的溶液介质有类似的物理和化学性质，且不易挥发。用其取代蛋白质溶液中的水介质，可使结构不受外来介质的影响。包埋剂：葡萄糖、海藻糖特点：生物大分子结构不变形；分辨率较高，理论上

9、可达3-4衬度差单宁酸（Tannic Acid）包埋用单宁酸取代蛋白质溶液中的水介质，可使蛋白质结构稳定并保持结构不发生变化。包埋剂：单宁酸特点：二维晶体的有序性保存的比较好；分辨率较高；衬度差冰包埋将样品悬液薄层迅速投入液态乙烷中，冷冻速度达到105 /s以上，水结成非晶态冰，蛋白质样品处于其中。冷台：常用液氮或液氦冷却特点：目前最好的样品包埋方法；高速冷冻形成的无序冰中，样品的水合状态得以保持，样品的结构不受破坏；可以获得高分辨率的结构数据；可以降低样品的辐射损伤；样品准备复杂；衬度差，但比糖包埋好冰包埋单颗粒重构几种主要技术基于模型的重构Random Conical TiltAngula

10、r Reconstruction无模型的未知结构基于模型重构流程图挑选高分辨像数字化测定并消除CTF挑选单颗粒像模型参考投影测定单颗粒取向三维重构比对收敛解释否是挑选单颗粒像挑选单颗粒像为什么比对(Alignment)？比对(Alignment)比对(Alignment)平移旋转取向相同的像的平均收敛参考投影投影平均像电镜三维重构现状目前分辨率（2006/7/15）二维晶体：3.5 1.9 螺旋结构：9 4 单颗：9 4.5 亚细胞（Tomography）：60 电镜三维重构发展趋势分辨率 = 原子（包括晶体和非晶体样品）动态过程结合其它学科：生物信息学、蛋白质晶体学自动化：样品准备、数据收集

11、、数据处理阅读资料1. Bradbury, S. and Turner, G. LE. (Eds) (1967) Historical aspects of electron microscopy.2. Erickson, H.P. (1973) The Fourier transform of an electron micrograph: first order and second order of image formation. Adv.Opt.Elec.Microsc. (R. Barer and V.E. Cosslett, eds.) 4, 1-843. Hayat, M.A.

12、 (1986) Basic techniques for transmission electron microscopy. Academic Press, N.-Y.4. Dubochet, J., Adrian,M., Chang, J.-J., Homo, J.-C., Lepault, J., McDowall, A.W., and Schultz, P. (1988) Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quat.Rev. Biophys. 21, 129-2285. DeRosier, D.J. and Moore, P

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14、.) Academic Press, New-York.阅读资料7. Amos, L., Henderson, R., and Unwin P.N.T. (1982) Three-dimensional structure determination by electron microscopy of two dimensional crystals. Prog . Biophys. Mol. Biol. 39, 183-231.8. Crowther, R.A. (1971) Procedures for three-dimensional reconstruction of spheric

15、al viruses by Fourier synthesis from electron micrographs. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 261, 221-2309. Crowther, R.A. & Amos, L. A. (1971). Harmonic analysis of electron images with rotational symmetry. J. molec. Biol. 60, 123-130.10. Fuller, S.D., Butcher, S.J., Cheng, R.H., and Baker T.S. (1996)

16、Three-dimensional reconstruction of icosahedral particles The uncommon line. J. Structural Biol. 116, 48-5511. Radermacher, M. (1988) Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J.Elec. Microsc. Tech. 9, 354-39412. Radermacher, M. (1994) Three-dimensio

17、nal reconstruction from random projections: orientational alignment via Radon transforms. Ultramicroscopy 53, 121-136阅读资料13. Frank, J. (1990). Classification of macromolecular assemblies studied as single particles .Q. Rev. Biophys. 23, 281-329.14. van Heel, M. (1984). Multivariate statistical class

18、ification of noisy images (randomly oriented biological macromolecules). Ultramicroscopy 13, 165-183.15. van Heel, M. (1987). Angular reconstitution : a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy 21, 111-124.16. Harauz, G. & van Heel, M. (1986b). Exact filt

19、ers for general geometry three dimensional reconstruction. Optik 73, 146-156.17. Penczek, P. (1998). Measures of resolution using Fourier shell correlation. J. Molec. Biol. 280, 115-116.18. Reimer, L. (1997) Transmission electron microscopy - physics of image formation and microanalysis. Springer-Verlag阅读资料19. Henderson, R. (1995). The