综合实验-几种乳制品中酪蛋白和乳糖的制备与鉴定(生化实验2)修改课件

1、1. 实验目的学习从牛奶中分离酪蛋白和乳糖的原理；掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法；学习常用蛋白质和乳糖的鉴定方法。三种品牌牛奶中酪蛋白和乳糖的制备与鉴定2. 实验原理 乳制品中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了其蛋白质总量的80%。乳制品在pH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强，分散性高，在乳中呈高分子状态。 本实验利用等电点时溶解度最低的原理，将乳制品的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 乳制品中的

2、糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖，由D-半乳糖分子与D-葡萄糖分子通过-1,4糖苷键连接而成。乳糖不溶于乙醇，但乙醇混入乳糖水溶液中，乳糖就会结晶出来，从而达到分离的目的。3. 器材与试剂 三种品牌牛奶、电炉、温度计、pH计、离心机、离心管、抽滤装置、表面皿(或一次性培养皿)、分析天平(万分之一)、恒温水浴锅、蒸发皿、烧杯、量筒、试管、吸管。 0.2 mol/L pH 4.7的醋酸(NaAc-HAc)缓冲液、冰醋酸、 CaCO3粉末、95%乙醇、0.9% NaCl溶液、茚三酮溶液、10% NaOH溶液、1% CuSO4溶液、浓硝酸、本尼迪试剂。三种品牌牛奶中酪蛋白和乳糖的制备与鉴定4. 实验操作（

3、1）酪蛋白的分离： 将20 mL新鲜牛奶盛于50 mL离心管中加热到40（在水浴锅中），在搅拌下慢慢加入预热至40、pH 4.7的醋酸（NaAc-HAc）缓冲液20 mL（提前在恒温水浴锅中预热）。用冰醋酸调节溶液pH至4.7（pH计，小心滴加；如过量，可用NaOH溶液调节），此时有絮状沉淀析出。将上述悬浮液冷却至室温，离心5 min（4000 rpm，注意平衡），上清液转移到烧杯中再加入CaCO3粉末中和冰醋酸（不需pH计，添加少量，沉淀不溶解即为过饱和。太多CaCO3会吸附上清液导致乳糖的损失）留作乳糖测定用，离心管中的沉淀即酪蛋白粗品。 离心管中沉淀用蒸馏水洗涤3次，每次约20 mL（用

4、玻璃棒充分搅拌），离心5 min（3000 rpm ，注意平衡），弃上清。往离心管的沉淀中加入约20 mL 95%乙醇，搅拌片刻，将离心管中的悬浊液转移到布氏漏斗抽滤（抽滤至没有明显变化，约20 min.可反复操作一次，洗净脂类杂质）。将沉淀转移至表面皿，捣碎摊开风干（置于干燥箱中，34 d），得到酪蛋白纯品。（2）乳糖的分离： 将上述实验所得的上清液加热煮沸（小烧杯在沸水浴中加热，通过热变性除去乳清蛋白），趁热过滤，除去沉淀的蛋白质和残余的CaCO3，将澄清滤液置于蒸发皿中，蒸气浴（将蒸发皿置于盛水的烧杯上，在电炉上加热至沸）浓缩至5 mL左右（目视确定），冷却后转移至小烧杯（或50mL离心管），加入20 mL 95%乙醇，加薄膜密封，4放置34 d（冰箱），让乳糖充分结晶。 （4）乳糖的含量测定及鉴定： 称重干燥的乳糖晶体，计算牛奶中乳糖的含量。 将乳糖晶体重新溶于水后，取2倍体积本尼迪特试剂（基于蓝色的碱性硫酸铜可被还原为红色的氧化亚铜的原理检查葡萄糖等还原糖的试剂），置沸水浴中加热数分钟，观察颜色变化。5. 时间安排 （1）12课时(8 hr)：原理及操作讲解、酪蛋白分离、乳糖的结晶（周六或周日上午9:30-下午5:30）； （2）3课时(2 hr)：酪蛋白含量测定及蛋白鉴定、乳糖晶体洗涤及干燥（下周