生物大分子相互作用课件

1、生物大分子相互作用徐文弟2010.9.29分子生物学研究的重要领域遗传中心法则基因表达调控细胞信号转导 关于中心法则Genome(cells repertoire of DNA)Transcriptome(cells repertoire of RNA transcripts)Proteome(cells repertoire of proteins)单个基因单个细胞中心法则组学关于基因表达调控Regulation of Gene ExpressionChromatinepigenetic controlRNA silencingProteindegradation一般而言的基因表达调控范畴基

2、因转录调节基本要素（一）RNA聚合酶 (RNA Polymerase)（二）特异DNA序列 (cis-acting elements)（三）调节蛋白 (trans-acting factors)Gene expression regulation at the level of DNA (transcriptional regulation)-highly sequence-dependent-varied regulation for different genes顺式作用元件：是决定真核基因转录活性的关键因素之一exon1intron1exon nintron n上游下游转录起始点增强子沉

3、默子启动子TATA盒GC盒CAAT盒增强子反式作用因子和顺式作用蛋白： 是真核基因的转录调节蛋白在真核细胞核中，有许多蛋白质能够帮助RNA聚合酶转录RNA。这类蛋白质统称转录因子（transcription factors，TF）或转录调节蛋白（transcription regulatory protein）。以反式作用方式调节基因转录的转录因子称为反式作用因子（trans-acting factor），以顺式作用方式调节基因转录的转录因子称为顺式作用蛋白（cis-acting protein） 。 真核基因的调节蛋白 反式作用因子 (trans-acting factor) 能直接或间接与

4、顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录的一类调节蛋白，统称为反式作用因子。 按其功能不同，常有以下三类： 基本转录因子 :识别promoter元件 转录调节因子:识别enhancer或silencer 共调节因子：不能进行DNA-蛋白质相互作用RNA聚合酶在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物polTFHTAFTFFTAFTAFTFATFBTBPTATA DNATAF: TBP associated factorsholoenzyme（1）基本转录因子 (general transcription factor) 能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合、并启动转录的一类调节蛋白。TB

5、P: TATA-box binding proteinTFII: pol II associated TF(2) 转录调节因子 (transcription factor, TF) 这类调节蛋白能识别并结合转录起始点的上游序列和远端的增强子元件，通过DNA蛋白质相互作用而调节转录活性。决定不同基因的时间、空间特异性表达.转录激活因子(transcriptional activator)转录阻遏因子(transcriptional repressor)（3）共调节因子 (transcriptional regulator/ co-factor) 首先与转录因子发生蛋白蛋白相互作用，进而影响它们的

6、分子构象，以调节转录活性,本身无DNA结合活性。 如果与转录激活因子有协同作用共激活因子； 与转录阻遏因子有协同作用共阻遏因子。最常见的 DNA binding domain锌指(zinc finger)C CysH His常结合GC box典型的类固醇激素受体结构示意图碱性亮氨酸拉链转录激活蛋白与调控区DNA相结合的示意图 碱性亮氨酸拉链（bZIP: basic Leu Zip)结构域转录激活因子序列比较 bHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)同源域(Homeodomain)蛋白通过其第三个螺旋与双链DNA的大沟相结合，其N端的延伸部分则与DNA的小沟相结合，提高了稳定

7、性 关于细胞信号转导细胞内存在复杂的信号转导网络信息转导过程信号分子在细胞内的合成信号分子从发出信号的细胞释放信号分子转运至靶细胞靶细胞上的特异性受体识别信号分子靶细胞内信号转导通路的启动靶细胞的代谢、功能或分化改变信号分子的清除及靶细胞应答反应的终止 在细胞中，各种信号转导分子相互识别、相互作用将信号进行转换和传递，构成信号转导通路（signal transduction pathway）。 不同的信号转导通路之间发生交叉调控（crosstalking）形成复杂的信号转导网络（signal transduction network）系统 。蛋白激酶的逐级磷酸化是细胞信号通路的重要特征 MAP

8、K的逐级磷酸化是将膜受体接受的信号转导至核内基因表达控制的重要环节，是细胞生长、分化和应激反应的共同信号通路蛋白质复合物：细胞信号转导通路的结构基础细胞中的各种蛋白分子不是独立的，而是聚集在一起形成蛋白质复合体，共同完成各种生命活动。 EGFR介导的信号转导过程生物大分子相互作用: 是信号转导网络控制基因表达的物质基础信号转导通路形成要求信号转导分子之间可特异性地相互识别和结合，即蛋白质-蛋白质相互作用，这是由信号转导分子中存在的一些特殊结构域介导的。这些结构域被称为蛋白相互作用结构域（protein interaction domain）。 蛋白相互作用结构域特点 一个信号分子可以含有两种以

9、上的蛋白质相互作用结构域，因此可以同时与两种以上的其他信号分子结合； 同一类蛋白质相互作用结构域可存在于多种不同的分子中。这些结合结构域的一级结构不同，因此对所结合的信号分子具有选择性，这是信号分子相互作用特异性的基础； 这些结构域本身均为非催化结构域。 蛋白相互作用结构域缩写识别模体Src homology 2 SH2含磷酸化酪氨酸模体Src homology 3 SH3富含脯氨酸模体pleckstrin homologyPH磷脂衍生物Protein tyrosine binding PTB含磷酸化酪氨酸模体WW WW富含脯氨酸模体蛋白相互作用结构域及其识别模体 衔接蛋白和支架蛋白：连接信号

10、通路与网络衔接头蛋白（adaptor protein）： 是信号转导通路中不同信号转导分子的接头，连接上游信号转导分子与下游信号转导分子。发挥作用的结构基础：蛋白相互作用结构域。功能：募集和组织信号转导复合物，即引导信号转导分子到达并形成相应的信号转导复合物。大部分衔接蛋白的结构中只有2个或2个以上的蛋白相互作用结构域，除此以外几乎不含有其他的序列。 衔接蛋白连接信号转导分子基因表达与细胞信号转导的偶联机制Coupling of Gene Expression and Cell Signalning转录因子染色质相关蛋白RNA加工蛋白RNA转运蛋白细胞周期蛋白细胞骨架NH2AAAAAm7GTr

11、anslation信号转导网络信号接收信号转导 应答反应 细胞信号转导的基本方式示意图 影响转录共调节因子p300的信号通路 关于ATP合酶ATP合酶组成可旋转的发动机样结构 F0的2个b亚基的一端锚定F1的亚基，另一端通过和33稳固结合，使a、b2和33、亚基组成稳定的定子部分。部分和亚基共同形成穿过33间中轴，还与1个亚基疏松结合作用，下端与嵌入内膜的c亚基环紧密结合。c亚基环、和亚基组成转子部分。 质子顺梯度向基质回流时，转子部分相对定子部分旋转，使ATP合酶利用释放的能量合成ATP。 关于阳性菌筛选 互补利用互补原理筛选重组体pUC18 关于生物大分子相互作用研究的关键技术酵母双杂交技

12、术的基本原理46酵母单杂交技术的基本原理47酵母三杂交基本原理 生物大分子研究相关技术 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科蛋白质组学应运而生。 蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。 对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一 迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白

13、质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。蛋白质相互作用研究当前进展1.利用蛋白质片段互补研究其相互作用和文库筛选2.通过核糖体展示进行相互作用的体外筛选和进化3.利用膜上肽合成法分析蛋白相互作用4.蛋白质成束法增强其相互作用的检测5.用计算方法分析全基因组蛋白质的相互作用6.通过蛋白质相互作用发展新的治疗方法7.利用核磁共振法分析蛋白质相互作用蛋白质相互作用的实验技术标签融合蛋白（Labeled fusion protein）免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）酵母双杂交（Yeast two hybrid system）荧光共振能量转移技术（FR

14、ET）表面等离子共振技术（Biacore SPR）原子力显微镜技术（Atomic force microscopy）噬菌体展示技术（Phage display）免疫共沉淀荧光共振转移技术噬菌体展示技术酵母双杂交技术基因外抑制子合成致死筛选分子生物学方法亲和印迹Pull down 试验遗传学方法蛋白质相互作用研究方法生物物理学方法酵母双杂交系统( Yeast two2hybrid system,Y2H) 酵母双杂交系统( Yeast two2hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质,到现在,双杂交系统已经成为检测和鉴定蛋白质相

15、互作用的标准方法,并且在旨在建立一系列蛋白质相互作用关系的蛋白质组研究中扮演着重要角色。 Y2H的建立是基于人们对酵母半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4的详细了解。GAL4包括两个可以独立的结构域: N 末端的DNA 结合域(DNA2binding domain,DNA2BD)和C末端的转录激活域( Transcrip tion activating domain, DNA2AD ) 。DNA2BD可以与DNA 分子的上游激活序列结合,DNA2AD则可以激活下游基因的转录,只有当两者在空间上充分接近时才会共同作用激活转录活性。 双杂交技术正是利用了GAL4的这一特点,将欲研究的两个目标蛋白的

16、编码序列分别与GAL4的结合域和激活域的编码序列融合,构建成两个杂交系统;再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵母细胞株;若两个目标蛋白发生相互作用,则会使DNA - BD和DNA - AD在空间上靠近进而激活报告基因的表达。 酵母双杂交系统简单快速,最常用于鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋白,同时也是发现新的蛋白质相互作用以及确定相互作用结构域的重要研究手段。 TRPC通道是一组Ca2 +流量调节通道蛋白,研究证明磷脂酶C1 (phospholipase C1, PLC21)结合并控制该通道,对降低Ca2 +流量是必要的,但一直没有鉴定出它们相互作用的结构域。 Rossum等人应用Y2H

17、系统,构建了pGBKT72BD2TR2PC3和pGADT72AD2 PLC21两个载体,共同转化到酵母当中,以Lacz为报告基因,发现PLC21只特异的与TRPC3相结合。实验人员又构建了载有不同氨基酸长度TRPC3 与PLC21的双杂交系统,发现TRPC3与PLC21的相互作用只依赖于TRPC3中对应的PH相似结构域中4046个氨基酸,从而建立了一个广泛的信号转导模型。融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流

18、出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。 为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase ,GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。 一般来说GST融合

19、蛋白pull-down方法用于两个方面： 一、鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二、鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用洗脱（2）结合（3）检测（6）收集（5）洗脱（4）固定诱饵蛋白（1）噬菌体展示 噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。 其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。 噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。 噬菌体展示技术 Phage display techniques, PDT 大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd和M13

20、,它们只感染含F因子的大肠杆菌。1985年,美国Missouri大学Smith博士等人将R I核酸内切酶基因片段连接到丝状噬菌体fd编码次要外壳蛋白的基因中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。 后经验证,该噬菌体能被EcoR核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术的诞生。 噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。 1990年Scott等人利用噬菌体展示技术构建了随机多肽文库,该文库由特定长度的随机短肽组成,理论上包含了某一固定长度短肽所有氨基酸

21、的排列组合方式。 由于蛋白质间的识别与结合主要取决于局部肽段中少数几个氨基酸,所以用受体蛋白对随机肽库进行亲和筛选,就能得到之结合的短肽序列,根据此短肽的序列,就可以得到与目的蛋白相互作用所依赖的氨基酸残基,从而可以进一步研究蛋白质之间的分子识别,酶与底物的结合等。 突破了传统研究蛋白质相互作用时需对其结构详尽了解的限制。丝状噬菌体蝌蚪形噬菌体噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体M13噬菌体 噬菌体展示技术最大的特点在于被展示在噬菌体表面的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性,建立起了基因型和表现型之间的一致性。 到现在已相继成功构建了f1、M13、T4 等噬菌体表达载体,为蛋白质组学的发

22、展提供了有利的工具。 Jespers等利用噬菌体展示技术,通过热变性发展了一种选择抗凝集蛋白的方法,这一方法的建立对于抗凝集蛋白的选择、鉴定;防止或促进蛋白的凝集反应以及诊断由凝集蛋白引起的疾病等方面都意义重大。串联亲和纯化Tandem affinity purification , TAP 串联亲和纯化( TAP) 1999年Rigaut等人共同提出了一套分离复合蛋白的新方法串联亲和纯化( Tandem affinity purification , TAP) ,兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点,为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一条新路径。 串联亲和纯化技术原理 串联亲和纯化技术

23、首先需通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个TAP标签,该标签由IgG结合结构域( ProtA ) 及一个钙调蛋白结合多肽(CBP)组成,结构域与多肽之间由一个TEV蛋白酶切位点隔开。 通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因。 温和裂解细胞,获取细胞抽提物,将抽提物加入IgG亲和柱,TAP标签的ProtA端会与IgG形成强结合,在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脱液将蛋白质复合体切割下来。 在钙离子参与下,被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合,充分洗脱,就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质,最后纯化出高纯度的目

24、的蛋白复合体。 利用串联亲和纯化技术,通过对洗脱后的复合体作质谱分析或电镜观察,可以快速的发现细胞中新的蛋白质复合体或鉴定出复合体中的新组分。TAP亲和层析纯化原理 TAP亲和层析纯化应用实例 Dziembowski等人应用TAP技术,纯化分析了酿酒酵母(Saccharom yces cerevisie)前体mRNA拼接酶复合体2U2微小核糖核蛋白颗粒( small nuclear ribo2nucleop rotein particle, snRNP)关联拼接因子SF3a和SF3b。在对SF3b的纯化中分离出了一个新的重要的蛋白亚基Ysf3p。 按照先前的观点,认为在酵母SF3b中存在一个S

25、nu17p亚基,是人类SF3b因子中p14 亚基的直系同源物, 在此次试验中却发现Snu17p不属于酵母SF3b因子,而是属于本实验中新发现的另一个拼接酶复合体RFS的一个组分。免疫共沉淀coimmunoprecipitation 非变性裂解完整细胞时，胞内许多蛋白质间的结合状态可以保持下来。如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀，则在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理性相互作用，被称为免疫共沉淀。 该技术在实际应用中常用融合表达的带有蛋白标签的特异性抗体与目标蛋白质或蛋白复合物结合，形成蛋白复合物沉淀。将蛋白质复合物溶解，再通过对蛋白标签具有特异吸附作用的亲和色

26、谱柱将蛋白复合物分离纯化出来, 进而通过凝胶电泳或质谱等技术鉴定分离的蛋白。 该方法常用来确定生理条件下目的蛋白在细胞或组织内是否存在与其相互作用的蛋白质。 免疫共沉淀法的优点是，所研究的相互作用蛋白均是经翻译后修饰的天然蛋白，可以表征生理条件下蛋白质间的相互作用。 但该方法需首先针对目标蛋白，制备出一定量的多克隆或单克隆抗体，过程相对复杂。同时，目的蛋白质只有达到一定浓度才能与抗体结合形成沉淀，因而该法只适用于研究具有高表达量的目标蛋白，应用范围有较大局限。 Dugan等利用该技术确定了细胞周期中cMyc和E2F两个转录因子间的相互作用。蛋白质片段互补分析（protein fragment

27、complementation analysis，PCA） 泛素蛋白可以分为两个片段，将编码这两个片段的基因分别与编码“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白的基因在胞质内进行融合表达，如果“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白发生相互作用，则泛素蛋白的两个片段得到重组而形成完整的泛素蛋白。 在泛素蛋白的介导下，作为泛素蛋白介导酶底物的报告蛋白被酶解，通过检测报告蛋白的含量变化监测蛋白质间的相互作用。 除泛素蛋白外，腺苷酸环化酶和氨基酸异构酶也可作为片段蛋白。 蛋白质片段互补技术也已成功应用于膜蛋白相互作用的系统化研究。以上方法是通过间接监测报告蛋白特性的改变来鉴定蛋白质相互作用，容易产生假阳性结果。现在通过将荧光蛋白

28、等报告蛋白作为蛋白互补片段与“诱饵”蛋白和 “猎物”蛋白融合表达，可通过直接监测荧光蛋白特性的改变来鉴定蛋白质相互作用。该种方法更为直接，减少了泛素蛋白介导酶解过程中的假阳性反应 。 该技术常用于检测环境因素或激素介导的蛋白质相互作用。 Westwick等用该技术从时间和空间两方面研究了Ras蛋白（一类GTP结合蛋白）与其调节因子及效应因子间的相互作用，为药物治疗Ras蛋白相关信号传导疾病指明了方向。 相对于酵母双杂交技术，蛋白质片段互补分析技术准确率较高，假阳性率较低，且能检测任何细胞类型的体内和体外的蛋白质相互作用。但该技术对融合蛋白的设计和表达要求较高。 化学交联法chemical cr

29、oss linking 化学交联是共价连接不同化学功能基团的技术，是对蛋白质化学修饰的简单延伸。蛋白质的亲核侧链和多肽链末端的活性氨基酸可与化学交联剂发生化学交联反应。相互作用的蛋白质是彼此结合或靠近的，可选择合适的化学交联剂，通过化学交联反应得到蛋白交联复合物，再利用蛋白质电泳或放射自显影等技术，即可鉴定出彼此间有相互作用的蛋白质。 化学交联法可以检测到很微弱的相互作用以及难溶的蛋白质（如膜蛋白）之间的相互作用，还可以使蛋白复合物锁定在某一特定构象，进而获取相对的和绝对的结构信息。 化学交联法适于研究能够形成稳定复合物的蛋白质间的相互作用。但化学交联法受交联剂种类、浓度,反应时间、温度及pH

30、值等条件的影响较大，条件优化过程繁杂，这在一定程度上限制了该技术的应用。 Dey等已利用该方法成功研究了大肠杆菌L7/L12蛋白与其延长因子的相互作用,并确定了个活性结构域。蛋白质芯片protein microarray 蛋白质芯片技术，是DNA芯片技术的扩展，即在固体支持物表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵，以特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。 蛋白质芯片技术主要用于进行自动化分析，支持高通量快速筛选。蛋白质芯片能够同时高效地分析上千种蛋白质间的相互作用,也使得在全基因组水平研究蛋白质的功能(如酶活性、抗体特异性配体、受体交互作用)成为可能。但该项技术的使用

31、受到了蛋白质固定化技术以及载体材料选择的限制，同时也需要复杂昂贵的仪器来对样品进行预处理和检测。 何为等通过固定规模化制备的多种抗体制作成抗体微阵列芯片，通过与荧光标记的人球蛋白和人白蛋白的相互作用,实现了高通量地对不同抗体株抗球蛋白和抗白蛋白活性的快速筛选与比较。抗体芯片 蛋白芯片技术的出现给蛋白组学研究带来新思路。蛋白组学研究中一个主要的内容就是要研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变。 微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，它也是蛋白芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。 这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经

32、用在研究的各个领域里。 第一张商品化的抗体芯片是由美国BD Clontech公司推出的。 这是一张用于研究的抗体芯片，芯片上排列了378种已知蛋白的单抗（Ab Microarray 380， 目录号 K1847-1），这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域。通过这张芯片，我们在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化。 微量热技术（microcalorimetry） 微量热法分为： 等温滴定量热（isothermal titration calorimetry,ITC） 差示扫描量热(different

33、ial scanning calorimetry,DSC) 其中等温滴定量热法可以用来研究蛋白质的相互作用，实验中通过将可能有相互作用的蛋白质溶液进行互相滴定。 每次滴定后，反应热放出或吸收，可以被ITC所检测到，检测到的热效应的热力学分析提供了相互作用的相关能量过程的定量特征，可以直接测量常温下发生相互作用过程中完整的相关的热力学数据，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（H）、恒压热容（Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km）,进而分析蛋白质间的相互作用。 等温滴定量热法常用于获取蛋白质间相互作用的完整的热力学信息。 微量热法能通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录

34、一个变化过程的量热曲线，原位和在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。 Jacobson等用等温滴定量热法研究了人细胞RNA聚合酶转录因子TFIID的最大亚单位TAFII250的组蛋白乙酰基转移酶活性。等温滴定量热法灵敏度较高，能测量到的热效应最低可达125 nJ，最小可检测热功率2 nW，蛋白样品最小用量0.4 g，响应时间小于10 s，但该法对样品纯度要求较高。原子作用力显微技术（atomic force microscopy, AFM） 原子作用力显微技术是在扫瞄隧道显微技术的基础上发展起来的。AFM通过力扫描方式，以单分子水平的高分辨率测量蛋白质间的相互作用力。 如在配体受体间相互作

35、用力的研究中，配体被固定于AFM的弹性悬臂表面，受体被固定于适当的基底表面，在悬臂接近和离开基底的过程中，通过悬臂的偏折便可测得配体受体间的作用力。 该技术常用于直接检测蛋白复合物解体期间的动力强度及自由能变化。原子作用力显微技术能直接有效地检测在外力作用下，蛋白质分子机械性质的改变。由于该技术常受到非特异结合力的干扰，导致结果误差较大。 Yuan等用该技术测得链霉抗生物素蛋白与生物素之间的结合力在115170 pN之间。荧光共振能量转移( Fluorescence resonance energy transfer,FRET) 荧光共振能量转移是近年来迅速发展的一种新技术,其最大的特点就是可

36、以在活体细胞生理条件下对蛋白质间的相互作用进行实时的动态研究,已成为现代蛋白质组学研究的有力工具。 一对合适的荧光物质构成一个能量供受体对时,能量在它们之间可以发生转移。 1948 年Frster提出的这一荧光共振能量转移理论奠定了FRET技术的理论基础。 1992 年, Prasher等首次从维多利亚水母中分离并克隆了一种荧光物质绿色荧光蛋白( green fluorescent p rotein, GFP) 。 随后, Heim等通过点突变等方式,得到了多种荧光光谱不同的荧光蛋白,如蓝色荧光蛋白( blue fluorescence p ro2tein ,BFP) ,黄色荧光蛋白( yel

37、low fluorescence p ro2tein , YFP) 和蓝绿色荧光蛋白( cyan fluorescence p rotein, CFP ) 等, 提供了大量的能量供受体, 为FRET技术提供了现实基础。 目前FRET技术中常用的荧光蛋白对是YFP和CFP,当与荧光基团融合的被研究蛋白发相互作用时,荧光基团在空间上靠近,发生能量转移,通过检测供受体分子发射程度比率的变化就可得知蛋白质结合程度的强弱。 目前, FRET技术已在检测酶活性变化、膜蛋白的研究、信号转导、细胞周期调控等研究中发挥了重要作用。 例如在细胞凋亡相关蛋白的研究中,天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶在细胞凋亡的执行期发

38、挥关键的作用。Reiko等利用FRET技术研究了Caspase8与其底物Bid蛋白质间的相互作用,将Bid蛋白两端分别与CFP和YEP融合,精心设计使其在没有被酶裂解前刚好可以发生共振能量转移,当Bid蛋白被裂解后,能量转移效应自然消失,从而很好的检测了Caspase8酶的活性。表面等离子共振( Surface plasmon resonance, SPR) 表面等离子共振是数理科学与生物学相互渗透、结合而产生的一种全新的研究生物大分子之间相互作用的方法,近几年在生物技术领域得到了广泛的应用。 表面等离子共振( Surface plasmon reso2nance, SPR)是一种物理光学现象

39、,当一束平面单色偏振光以一定角度入射到镀在玻璃表面的薄层金属膜上发生全反射时,若入射光的波向量与金属膜内表面电子的振荡频率相一致,光线即被耦合入金属膜引发电子共振,即表面等离子共振。由于共振的产生,导致反射光的强度在某一特定的角度大大减弱,反射光消失的角度称为共振角( SPR angle) ,共振角随金属表面折射率的变化而变化,而折射率的变化又与金属表面结合物的分子质量成正比。 在20世纪90年代发展了应用SPR原理检测生物传感芯片( biosensor chip ) 上的配位体与分析物作用的一种新技术表面等离子共振。 在该技术中,待测生物分子被固化在生物传感芯片上,使另一种被测分子的溶液流过

40、表面,如二者发生相互作用,就会引起芯片表面折射率的变化,从而导致共振角的改变,通过检测该共振角的变化,就可实时监测分子间的相互作用。 1992 年, Fagerstam 等首次将此技术用于生物特异相互作用分析( biospecific interaction analysis , BIA) 之后,由于该技术快速、安全、无需标记以及高灵敏度等特点,已被广泛用于分析生物分子如蛋白质间、蛋白质与核酸、核酸之间的相互作用,涉及免疫识别、信号传导、药物筛选和蛋白质构象变化等多个研究领域。基于计算分析和构建相互作用模型的方法 全基因组计算分析法（analysis of genome wide protei

41、n interactions by computational approaches） 基因组中的基因和蛋白质组中的蛋白具有遗传和翻译的上下对应关系。因此，可以从完整的基因组序列获取更多的蛋白质遗传翻译信息，包括基因本身及位置的保守性、基因组内的基因融合分析、代谢重建及基因共调控等。 基于以上信息，运用大规模高效的数值计算和理论模型来识别基因组序列中代表蛋白质的编码区，破译隐藏在核酸序列中的遗传语言规律，可以获知蛋白质复合物的形成以及蛋白质在代谢和信号通路中的直接或间接作用。 该法的特点是：充分整合了基因组和蛋白质组的研究信息，能够有效预测相关的蛋白质相互作用，指导蛋白质相互作用的实验研究。

42、但该方法必需和具体的实验技术结合，才能确认不同蛋白质间的相互作用。如Uetz等利用全基因组计算分析法，耦合酵母双杂交技术准确鉴定出了啤酒酵母细胞中的957种蛋白质相互作用。构建相互作用模型法（integrate networks and models） 人们在研究蛋白质相互作用的同时，也建立了多种蛋白质相互作用数据库，基于合理的运算程序，有效地整合分析实验数据，建立蛋白质相互作用网络模型。 该方法可以对参与和调节某个生理过程的各种蛋白质间的相互作用进行有效系统研究，进而研究代谢、信号传导、遗传调控等调节生命活动的重要功能途径。 如Ideker等基于GraphWin程序，将Schwikowski

43、等给出的酵母细胞中2709对蛋白质相互作用数据进行分析整合，绘制出相互作用网络图，进而从中发现Gal4p、Gal11p和Gal80p三种蛋白质间的相互作用调控着酵母中半乳糖代谢途径中的多个重要进程。 相关数据库生物分子相互作用网络数据库（BIND） 蛋白相互作用数据库（DIP）蛋白相互作用数据库的JSP链接http:/point.bioinformatics.tw/intro/intro.jsp DNA与蛋白质相互作用研究方法研究技术新进展 随着分子生物学和生物技术的迅猛发展,传统的生物化 学和物理化学研究方法已不能满足现有的实验要求,分子生物化学家们力求建立和发展更为有效、灵敏、快速和精确的

44、鉴定 DNA - 蛋白质相互作用的方法。 核酸适体技术、荧光技术、扫描探针显微镜技术、等离子共振技术、质谱技术和分子模拟等先进手段应运而生,并促进该研究领域沿微观方面发展。 目前对以蛋白质为主的生物大分子的研究已经进入了一个新的层次。其重要特点不再是满足于对单一生物大分子的研究，而是综合各种分析方法来研究一个完整的生物学途径或一个细胞或细胞器中蛋白质、核酸、多糖等分子之间识别和相互作用的机制。其中DNA与蛋白质间相互作用参与许多生物学过程。92酵母单杂交技术的基本原理酵母单杂交技术yeast one hybrid system该技术是由Li J J 和Herskowitz 从酵母双杂交技术发展

45、 来的。通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析,来鉴定DNA 顺式作用元件和转录因子的结合情况;通过筛选DNA 文库,来获得与靶序列特异结合的蛋白质基因序列。其原理是:根据大多数转录因子含有DNA 结合结构域(DNA - binding domain ,BD) 和转录激活结构域(activation domain ,AD) ,且两结构域可完全独立地发挥作用的特点,来设计携带有编码“靶蛋白”的文库质粒,从而使文库蛋白编码基因置换酵母原有转录因子GAL4 的DNA 结合结构域,并通过表达的“靶蛋白”与目的基因相互作用来激活RNA 聚合酶,启动下游报告基因的录。该系统需包含: 将文库蛋白的编码基因与

46、 GAL4 转录激活域融合表达的cDNA 文库质粒; (2) 含目的基因与下游报告基因的报告质粒。 其中,文库的设计和筛选实验是整个酵母单杂交系统的核心技术。 酵母单杂交系统已被用于克隆多种重要的DNA 结合蛋白,该系统相对直接、快捷、灵敏,筛选到的蛋白是在体内相对天然条件下有结合功能的蛋白质,比其他体外技术获得的结果更能体现真核内基因表达调控的真实情况,且无需复杂的蛋白质分离纯化操作。但因细胞技术的先天局限性和所用报告基因His3 或lacZ的自泄漏表达等缺陷,在实际操作中常出现漏检和假阳性现象。 DNA-蛋白质印迹杂交 主要用于调控蛋白与调控元件相互作用的研究，是根据位点特异性结合蛋白借助

47、于氢键、离子键和疏水键与同位素标记的特异序列探针结合，通过放射自显影体系对 结合蛋白进行定性、定量及对基因组结合序列进行定位分析的一种方法。DNase足迹法DNase footprinting 常用于体外DNA - 蛋白质相互作用的鉴定。该方法于1978 年引入科研领域,其原理与DNA 的化学测序法相似,即用DNase 部分消化已进行单链末端标记的待测双链DNA ,形成在变性聚丙烯酰胺凝胶上以相差一个核苷酸为梯度的DNA 条带。 当DNA片段与其特异性结合的蛋白结合后,DNA 结合蛋白就阻碍DNase 在结合位点及其周围部位的结合,形成切割梯中的空白区域,结合DNA 化学测序法,就可知该结合区

48、的碱基序列。 该技术在实际操作中涉及了有机抽提、离心等蛋白纯化步骤, 较为繁杂,因此在该足迹法的基础上又发展了固相DNase 足迹法 ,它具有如下优点采用生物素进行末端标记,避免放射性同位素的掺入,减少危害; (2) 省略了有机抽提、沉淀等蛋白纯化步骤,操作简便,效率高;(3) 使用范围广,可适用于未经纯化的核蛋白粗提物内特异性DNA 结合蛋白的研究。 凝胶阻滞电泳 该方法是一种简单、快速检测DNA结合蛋白的方法。 在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳中DNA和蛋白质的复合物的迁移速度比单一的DNA片段或双链的寡核苷酸要慢。免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation ana

49、lysis , ChIP) 其原理是在活细胞状态下利用甲醛或其他交联剂固定蛋白质- DNA 复合物,经超声破碎、特异性抗体沉淀复合体,后解除偶联、纯化目的片段并检测等步骤来获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP能捕捉到发生在染色质水平上的基因表达调控的瞬时事件,如实、完整地反映DNA 与蛋白质的动态结合 ,但该方法尚存些不足,如:难以同时得到多个因子对同一序列结合的信息,或目标蛋白不是直接地与染色质结合 等。 近年来,研究者不断地发展和完善此技术,建立了广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选的CHIP - chip (芯片)方法和研究RNA 在基因表达调控中的作用的RNA - CHIP方

50、法等。 该技术在国外已得到广泛应用,但在国内尚未成熟应用。 SELEX技术 适配分子技术是一种最近发展起来的体外筛选和放大技术，通过该技术可得到一段能与各种目标分子高亲和、高特异结合的核酸序列，该核酸序列称之为适配分子(aptamer)。 Aptamer一词来源于拉丁文Aptus，意即适合的意思(fit)，而这种体外的筛选技术称之为指数级富集配体系统进化技术即SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)。 简言之，Aptamer就是一段核酸序列，它能与相应的配体高特异性和高亲合力地结合。从原始文库中筛选配体相应

51、的Aptamer的技术称为SELEX技术。 Aptamer具有广泛的实用性，它能用于任何以分子识别为基础的诊断和治疗。原理 从大量的随机序列的寡核苷酸库中鉴定出一种数量很少的具有独特性质的核酸序列的方法是由Tuerk和Ellington等在1990年建立的，它是一种通过体外反复选择和放大从核苷酸组合库中筛选特定核苷酸序列的方法。 SELEX过程中，首先是用组合化学合成DNA的方法合成随机序列的核酸库，库中的每一个成员是一个线形的寡聚物，库中分子多样性的程度取决于随机寡核苷酸的长度。 理论上讲，一个40个碱基的随机序列可有1.2 X 1024种核苷酸排列顺序(440 =1.2 X 1024)。实

52、际上1mol的固相DNA合成的随机组合核苷酸库的序列多样性仅限制于10141015种，能否找出与靶分子相互作用的稀有序列，很大程度上取决于组合库的多样性，在所有种类的组合随机序列库中寡核苷酸库的多样性最为丰富。 筛选过程中，首先在一定的温度下将寡核苷酸随机序列库与靶分子共同孵育于特定的缓冲液中，组合库中的极少数分子将与靶分子结合，然后用物理的方法将结合的分子与末结合的分子分离开来。标准的方法是将蛋白靶分子固定于硝酸纤维素滤膜上，而其他小的靶分子则固定于固相载体的表面，因此，未与靶分子结合的序列很容易被冲洗掉，而与靶分子结合的序列将被分离出来并放大以获得一个序列库，再对这一序列库进行下一轮的筛选

53、和放大。SELEX技术原理 由于aptamer 具有精确识别、易体外合成与修饰等特性，SELEX 技术在分析化学、基因调控、蛋白质组研究、疾病治疗与新药研发等方面得到广泛的应用。 更重要的是，aptamer 的靶分子范围很广，与靶分子间的亲和力和特异性更高，从SELEX 技术建立至今，SELEX 技术和aptamer 的研究不断受到新的挑战与更新。SELEX与核酸适体技术其筛选过程包括: 体外合成单链寡核苷酸序列的随机文库; 在适宜条件下,孵育单链寡核苷酸库与靶蛋白形成DNA - 蛋白质复合物; 分离未与靶蛋白结合的寡核苷酸; 解离与靶蛋白结合的寡核苷酸,以此为模板进行PCR 扩增,得到特异结

54、合的寡核苷酸库,再进行下轮的筛选过程; 通过反复筛选与扩增,得到亲合力强于抗原抗体之间的高特异核酸适体。SELEX 技术至问世来就以惊人的速度发展,因其库容量大、特异性高、亲和力强等优点,在靶物质的筛选上得到了广泛应用,也为DNA - 蛋白质相互作用研究提供了一 种新颖的研究方法。用于DNA - 蛋白质相互作用研究的指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment ,SELEX)是一种新型的体外筛选技术,它以DNA 与蛋白质相互作用为基础建立随机寡核苷酸文库,从中筛选到能与各种配体(靶蛋白) 特异性结合的单

55、链寡聚核苷酸片段, 长度一般为20 40bp ,该寡核苷酸片段就称为核酸适体(aptamer) 。 核酸适体技术已成为适配体筛选的有效工具,其所结的靶分子范围非常广泛,除蛋白质之外,还可以是酶、核酸、细胞黏附分子、植物凝集素、病原菌、有机物甚至是金属离子等,且筛选到的适配体能识别单抗不能区分的蛋白质。 基于这些特性,核酸适体技术已在基础研究、临床诊断、药物筛选、生物传感器等领域应用。 SELEX 技术是体外实验,其筛选到的核酸适体所表现出的一些优良性质,在体 内实验中可能会完全失效;核酸适体与靶分子的非特异性结合及适配体的同源性、亲和力等的影响,造成了SELEX的前期筛选工作的复杂性。这也是SELEX 技术亟待解决的两个问题。如果完成适配体的各种有效修饰及安全的药物评价模型的构建,SELEX技术存在的问题也将逐步解决。 荧光技术 该技术已广泛用于生物分子之间的相互作用研究。由于核酸及其链上的碱基的荧光产率很低,蛋白质组成里也只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有天然荧光,所以采用“内源荧光”的分析方法受到了很大的限制。 用于研究DNA - 蛋白质相互作用的荧光法,主要是将荧光物质修饰到蛋白质或核酸分子上构成新型荧光标记物质并结合相关仪器而改造成新型的检测技术。它对待测物质的浓度要求低,灵敏度高且部分荧光技术可实现对待测物质的动态