分子生物学实验技术基因操作工具酶

1、第一节 基因操作工具酶第一页，共四十八页。酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶 S1核酸酶Klenow酶DNA酶 Taq DNA 聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶第二页，共四十八页。主要内容1 限制性核酸内切酶2 DNA连接酶3 DNA聚合酶4 修 饰 酶5 小 结第三页，共四十八页。酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶 或Klenow酶1 制作DNA探针；2 合成cDNA第二链；3 填补双链DNA 3凹端；4 DNA测序。Taq DNA 聚合酶聚

2、合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome第四页，共四十八页。1 限制性核酸内切酶1.1 引 言1.2 命 名1.3 分 类1.4 活性及影响因素Home第五页，共四十八页。核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。（1）按作用对象分: DNAase & RNAase（2）按断裂核酸分子不同方式分

3、： Endonuclease & Exonuclease 1.1 引言两个概念第六页，共四十八页。限制性内切核酸酶（restriction endonuclease): 指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。 限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-Modification System)。Back第七页，共四十八页。1.2 命 名命名原则：第一个字母（大写, 斜体）： 该酶来源的微生物属名；第二、三个字母（小写、斜体）：微生物种名；若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写）若从同

4、一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。例如：EcoR 从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为EcoR， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（coli)，R 代表株系（RY13）， 代表该菌株中首次分离到。Back第八页，共四十八页。1.3 分 类1.3.1 型限制性内切酶 型限制性内切酶1.3.3 型限制性内切酶Back第九页，共四十八页。1.3.1 型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，无固定切割位点；应用：不常用。Back第十页，共四十八页。1.3.2 型限制性内

5、切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在距识别位点3端24-26 bp处。应用：数量很少，无实际作用。Back第十一页，共四十八页。1.3.3 型限制性内切酶功能：识别并特异切割DNA分子。 即通常所指DNA限制性核酸内切酶；反应特点：仅需 Mg2+ 作催化反应辅助因子，能识别双链DNA特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异片段；应用：种类繁多，分子克隆中最为常用第十二页，共四十八页。(1) 基本特性识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；许多识别序列具回文结构，如Hind 的识别序列： 5 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5切割产生末端有粘

6、端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (GGATCC) 和平端 (blunt end) 如Sma I (CCC GGG)第十三页，共四十八页。EnzymeRecognition seuqenceEnzymeRecognition seuqenceBamH IGGATCCPst ICTGCA GBgl II A GATCTSal IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN NGGCCHind IIIA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot

7、IGC GGCCGCXho IC TCGAGRecognition Sequences and Cutting sites of Restriction Endonucleases 第十四页，共四十八页。(2) 同功异源酶(isoschizomer) 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。如：BamH I (GGATCC)和Bst I (G GATCC)注：有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。第十五页，共四十八页。(3) 同尾酶（isocaudamer) 识别序列不同，但产生相同粘性末端的限制酶。 如：BamH I : GGATCC Bgl II : AGAT

8、CTBack第十六页，共四十八页。1.4 活性及影响因素(1) 活性大小：酶对DNA水解程度不同。(2) 酶的活性单位： 指1g 纯的指定DNA在指定缓冲液中，于37（最适温度更准确）酶解1 h完全酶解DNA中所有同一限制性内切酶位点所需的酶量。第十七页，共四十八页。(3) 影响因素 DNA模板的纯度 DNA的甲基化程度 酶切反应温度 DNA的分子结构 缓冲液Back第十八页，共四十八页。2 DNA连接酶2.1 定义及功能2.2 种类及作用机理2.3 使用时的注意事项Home第十九页，共四十八页。2.1 定义及功能 DNA连接酶（DNA ligase）： 可使一段DNA 3-OH末端和5-P

9、末端形成3,5-磷酸二酯键，把两DNA片段连在一起封闭双链上形成的切口的酶。第二十页，共四十八页。OH P53355335DNA ligaseDNA ligase 连接缺刻(nick)Back第二十一页，共四十八页。 两类: T4 DNA连接酶(ATP提供能量） 大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量）2.2 种类及作用机理第二十二页，共四十八页。T4 DNA ligase 的作用机理Back第二十三页，共四十八页。1)不能催化两单链DNA分子连接；2)只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口(gap)。2.3 使用时的注意事项第二十四页，共四十八

10、页。DNA ligase 的活性Back第二十五页，共四十八页。3 DNA聚合酶（DNA polymerase）3.1 DNA聚合酶 I3.2 Klenow聚合酶3.3 Taq DNA聚合酶3.4 逆转录酶3.5 T4 DNA聚合酶3.6 T7 DNA聚合酶Home第二十六页，共四十八页。3.1 DNA聚合酶 活性：53聚合活性，53外切和35 外切活性。发挥生物学活性的条件：（1）DNA模板（可以是单链或双链）（2）带有3-端游离羟基的引物链（3）底物和激活剂注：对双链DNA，当有dNTP存在时， 35降解活性会被53方向的聚合活性所抑制。应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针第二十七页，共

11、四十八页。缺口DNase IDNA聚合酶 IDNA聚合酶 IdNTP*缺口缺口平移法制备DNA分子探针Back第二十八页，共四十八页。活性： 53聚合活性，35 外切酶活性，无53 外切酶活性。用途： （1）填补或标记DNA的3隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定3.2 Klenow聚合酶第二十九页，共四十八页。EcoR I 酶切末端同位素标记的EcoR I 酶切末端- 32P-dATPBack第三十页，共四十八页。显著特点：热稳定性。70反应2h残留活性90 %； 93 反应 2 h残留活性60% ；94 反应 2 h残留活性40%。应用：（1）对DNA的特定片段

12、进行体外扩增； （2） DNA序列测定。3.3 Taq DNA聚合酶Back第三十一页，共四十八页。逆转录酶 (reverse transcriptase)： 又称RNA指导下的DNA聚合酶。活性： 53聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3-OH的RNA或DNA。3.4 逆转录酶第三十二页，共四十八页。逆转录酶的活性第三十三页，共四十八页。 用途：（1）在体外以mRNA为模板合成cDNA；（2）对有5突出末端的DNA片段作末端标记（补平）；（3）双脱氧法测序；（4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针。Back第三十四页，共四十八页。活性： 53聚合酶活

13、性和35外切酶活性，且35外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。 高浓度dNTP 环竟下前者活性更强。应用：标记DNA平末端或隐蔽3末端3.5 T4 DNA聚合酶Back第三十五页，共四十八页。活性：53聚合酶活性；有单链及双链的35外切酶活性，但无53外切酶活性；特点：极佳的连续合成能力应用：（1）用于长模板DNA的引物延伸反应；（2）通过单纯延伸或取代合成途径标记DNA 3末端；（3）使双链DNA 5或3突出末端变平末端。3.6 T7 DNA聚合酶Back第三十六页，共四十八页。4 修饰酶4.1 碱性磷酸酶4.2 末端转移酶4.3 T4多核苷酸激酶4.4 S1核酸酶 Home第三十

14、七页，共四十八页。4.1 碱性磷酸酶功能：催化核酸脱5-磷酸基团，使DNA或RNA片段5-P末端转换成5-OH末端。来源：大肠杆菌： bacterial alkaline phosphatase (BAP); 小牛肠道: calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)。第三十八页，共四十八页。碱性磷酸酶的活性第三十九页，共四十八页。 注意：CIP的比活性比BAP高出10-20倍，且CIP在SDS中68就可完全失活，而BAP却是热抗性酶。Back第四十页，共四十八页。来源: 前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。功能：催化DNA进行53方向的聚合作用, 逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3-OH端。4.2 末端转移酶 (terminal transferase)第四十一页，共四十八页。末端转移酶的催化作用第四十二页，共四十八页。 用途：(1) (主要)给外源DNA片段和及载体加互补同聚物尾巴；(2) 标记DNA片段的3末端。Back第四十三页，共四十八页。4.3 T4多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase (PNK) 来源: T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 功能：催化-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA的5-OH末端（图）