标记免疫技术课件

1、基本概念一、免疫标记与标记免疫的概念免疫标记技术：标记物与免疫活性物质的联接技术标记免疫技术：以标记免疫物质检测相应靶物质的技术标记的目的.?基本概念一、免疫标记与标记免疫的概念标记的目的.?二、常用的免疫标记物质类别 标记物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 二、常用的免疫标记物质类别 酶标仪酶标仪荧光显微镜荧光显微镜F

2、CM检测分析细胞表面受体的表达FCM检测分析细胞表面受体的表达液闪仪计数器液闪仪计数器金 免 疫 技 术金 免 疫 技 术吸水纸吸水纸金标抗体包被抗体抗金标抗体吸水纸吸水纸金标抗体包被抗体抗金标抗体化学发光免疫分析技术 化学发光酶免疫测定：测定过程与传统ELISA相似，仅最后一步酶反应所 用底物为发光剂（鲁米诺-过氧化氢发光体系）化学发光免疫分析技术 化学发光酶免疫测定：测定过程标记免疫技术的分类一、按指示标记物质划分的类型二、按测定方式划分的类型三、按测定用途划分的类型标记免疫技术的分类一、按指示标记物质划分的类型1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、化学发光免疫分析技术5、金免

3、疫技术按指示标记物质划分的类型1、酶免疫技术按指示标记物质划分的类型1、均相型（homogenous）2、非均相型（异相型 heterogeneous）按测定方式划分的类型1、均相型（homogenous）按测定方式划分的类型均相型（homogenous）反应完成后，不用分离结合与游离的标记物非均相型（异相型heterogeneous）反应完成后，要分离结合与游离的标记物。又可分为液相异相免疫测定和固相异相免疫测定均相型（homogenous）非均相型（异相型heterog1、免疫测定技术2、免疫组化技术按测定用途划分的类型1、免疫测定技术按测定用途划分的类型第八章 酶免疫技术第八章 酶免疫技

4、术本章要求熟悉酶免疫技术的分类及原理；掌握ELISA的方法类型及各方法的原理；测定方法的标准化；熟悉酶免疫组织化学技术的原理；了解各类酶免疫组织化学技术；熟悉免疫印迹法的原理。本章要求熟悉酶免疫技术的分类及原理；酶免疫技术的基本原理酶免疫技术是以酶标记抗原或酶标记抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被测物进行定性或定量的标记免疫技术。 酶免疫技术的基本原理酶免疫技术是以酶标记抗原或酶在免疫组化染色时可指示待测反应物的存在和定位，在酶免疫测定中，则可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，故而该技术具有检测灵敏度高、特异性

5、强、准确性好等特点，而且，可与其他技术偶联而衍生出适用范围更广的新方法。 在免疫组化染色时可指示待测反应物的存在和定位，在酶 酶免疫技术的分类 按检测对象的不同一般分为两类 1.酶免疫组织化学技术 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体。可指示待测反应物的存在和定位。2.酶免疫测定技术 用于检测液体样本中可溶性抗原或抗体。 根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。 酶免疫技术的分类 按检测对象的不同一般分为两标记免疫技术课件酶免疫技术的分类 根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物，可分为： 1. 均相法：不需要分离结合和游离的酶标记物，直接进行测定。 2. 异相法：需要分离

6、结合和游离的酶标记物后才能进行测定。 固相酶免疫：ELISA 液相酶免疫酶免疫技术的分类 根据抗原抗体反应后是否需要分离结酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)基本原理 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。 标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体能按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开。最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 加入酶底物，底物被酶催化变为有色产

7、物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅对标本中的抗原或抗体定性或定量分析。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunos 方法类型及基本原理ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。双抗体夹心法 双位点一步法间接法 竞争法 捕获法 双抗原夹心法中和法方法类型及基本原理ELISA可用于测定抗原，也可用于测定一、双抗体夹心法属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-

8、酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。一、双抗体夹心法属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该

9、抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结（二）双位点一步法属于双抗体夹心法测定抗原；应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体；标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。但要注意防止钩状效应。（二）双位点一步法属于双抗体夹心法测定抗原；（三） 双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物

10、。形成“抗原-抗体-酶标记抗原”复合物（三） 双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物四、间接法此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。 基本原理:将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。四、间接法此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。 特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合抗原及杂质；加待测血清，血清中若有相应的抗体则与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合

11、物。洗涤后，固相载体上仅剩下特异性抗体。其他免疫球蛋白及杂质不能与固相抗原结合被去除；加酶标抗免疫球蛋白（酶标抗抗体）与固相复合物中的抗体相结合。洗涤后，固相载体上的酶量与待测血清中特异性抗体的量相关。若欲测人对某种病原微生物的抗体，可用酶标记羊抗人IgG抗体；加入底物显色，颜色深浅代表样本中待测抗体量。 特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合抗原五、竞争法 方法和特点: 酶标记抗原（抗体）与样品或标准品中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力； 测定管中加入待测样本与一定量酶标抗原（抗体）的混合溶液，使两者竞争性的与固相抗体（抗原）反应； 免疫反应后，结合于

12、固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比。 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。五、竞争法 方法和特点: 标记免疫技术课件六、捕获法测IgM抗体 先将针对IgM的第二抗体连接于固相载体，用以结合（“捕获”）样品中所有IgM（特异或非特异），洗涤除去IgG等无关物质，然后加入特异抗原与待检IgM结合；再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。 六、捕获法测IgM抗体 先将针对IgM的第二抗体连接于固相载抗-链（或抗-IgM抗体）包被在固相

13、上，形成固相抗-链（或抗-IgM抗体），洗涤；加入稀释待测样本，样本中所有的IgM与抗-链结合，洗涤除去未结合物质；加入特异性抗原，它只与固相上特异性的IgM结合。洗涤；加入针对特异性抗原的酶标抗体，使之与结合在固相上抗原结合，洗涤；加底物显色，若有颜色显示，则表示待测样本中有特异性的IgM抗体存在。抗-链（或抗-IgM抗体）包被在固相上，形成固相抗-链七、中和法常用于已知中和抗原检测样本中的未知抗体。在固相上包被已知抗体，当检测样本中含有待测抗体时，与反应体系中加入的中和抗原结合，反应过程不能形成“抗体-抗原-酶标记抗体”复合物，加入底物不显色，实验结果判为阳性；当检测样本中无待测抗体时，加

14、入的中和抗原则与固相抗体结合，形成“抗体-抗原-酶标记抗体”免疫复合物，加入底物显色，实验结果判为阴性。七、中和法固相酶免疫测定的技术要点ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液固相酶免疫测定的技术要点ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸试剂的准备固相载体：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白质的能力较强，抗体或蛋白质抗原吸附其上并保留原来的免疫活性。载体的性状主要有三种：小

15、试管、小珠和微量ELISA板。抗原和抗体：所用抗原要求纯度高，抗体效价高，结合力强。酶和底物： ELISA中最常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶试剂的准备固相载体：最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯吸附蛋白质的酶和酶作用底物要求活性高 有可结合的基团，不影响抗原抗体的免疫活性 反应产物易于判定或测量，方法简单,敏感,重复性好 酶活性不受样品中其他成分的影响,在均相酶免疫测定抗原抗体反应后酶活性可被抑制或激活 本身及产物无危害,性质稳定,价廉易得 酶和酶作用底物要求活性高 常用酶及酶的底物DH2 + H2O2 D + 2H2O 底物 受氢体 E 有色物质 辣根过氧化物酶 (HRP) 邻苯二胺(OPD

16、) 灵敏度高,比色方便，稳定性差,避光,致癌 四甲基联苯胺(TMB) 稳定性好,无致突变作用，水溶性差碱性磷酸酯酶 (AP) 底物: 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 产物: 黄色的对硝基酚-半乳糖苷酶 (-Gal)底物: 4-甲基伞酮基-D-半乳糖苷(4MuG) 产物: 4-甲基伞形酮(荧光计测量)常用酶及酶的底物DH2 + H2O2 酶 底物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺 橙黄色 492 四甲基联苯胺 黄色 450 氨基水杨酸 棕色 550 2,2-氨基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐蓝绿色 642 碱性磷酸酯酶 对硝基苯磷酸酯（p-NPP）黄色 405 -半乳糖苷酶 4

17、-甲基伞酮基-D-半乳糖苷荧光 360,450 酶 底物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺 橙黄常用酶 底物 加终止液前颜色 加终止液后颜色 辣根过氧化物酶（HRP） 邻苯二胺（OPD） 橙黄色 棕黄色 RZ3.1 四甲基联苯胺（TMB） 蓝色 黄色 碱性磷酸酶（AP） 对硝基苯磷酸酯（p-NPP） 黄色 黄色 常用酶 底物 加终止液前颜色 加终止液后颜色 辣根过氧化物酶标记免疫技术课件交联法 交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为： 酶-1-戊二醛-2-抗体（抗原） 1=2

18、同源双功能交联剂 戊二醛 1=2 异源双功能交联剂 羟琥珀亚胺酯 戊二醛易挥发，久置可发生聚合和氧化，降低交联作用。由于戊二醛单体的光吸收峰是280nm，而聚合体则在235nm，故新鲜的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛应避光.低温保存。 交联法 直接法 直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。形成的结合物为：酶-抗体（抗原）。 直接法 测定方法的标准化包被+封闭加样洗涤孵育终止反应结果的判定测定方法的标准化包被+封闭包被将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载

19、体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。包被将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被(coating包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。包被用抗体IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc

20、段上，抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。包被用抗原：包被条件pH9.6 碳酸盐缓冲液pH7.2 的磷酸盐缓冲液蛋白质用包被液稀释后加入酶标板（100或200l/孔），在4-8冰箱中放置过夜或37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。包被条件pH9.6 碳酸盐缓冲液封闭封闭(bloc

21、king)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 200l/孔10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白（二）加样 定量测定加样量应力求准确，加样时应将液体加在孔底，力求不产生气泡。样本和结合物的稀释应按规定配制。 一般100l/孔（三）洗涤 洗涤是决定实验成败的关键。其目的是洗去没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 Tween 2

22、0在ELISA中最为常用，洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。常用PBS- Tween 20。 洗涤步骤（二）加样孵育 (incubation) 抗原抗体完成反应的保温过程称为孵育 加样品后、加结合物后都要孵育 孵育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。 一般孵育30-60min，温度低，时间可延长。孵育 (incubation) 抗原抗体完成反应的保温过程终止反应硫酸 柠檬酸 氢氧化钠 不同的底物有不同的终止剂 终止反应硫酸 （五）结果的判定 分光光度计检测结果可简单地用吸光度值（A）表示，并

23、且根据每次试验所用的阴性和阳性样本确定标准。一般以A/A02.1（A：样本吸光度值，A0：阴性对照吸光度值）表示，但阴性对照吸光度值必须大于0.05（最理想的是0.1），若低于0.05，则以阴性对照吸光度值加0.05为阳性判断标准，这种结果判定方式目前最常用。用标准抗原或抗体做一系列稀释度检测，将测定的A值绘成标准曲线，可对样品中抗原或抗体定量。用肉眼判断结果时，所用的底物必须显示较深的颜色。肉眼观察只能判断阳性和阴性（如+、+、+、+/、）。（五）结果的判定 分光光度计检测结果可简单地用吸光度值（A）标记免疫技术课件酶免疫组织化学技术（EIHCT ）是在一定条件下，应用酶标抗体(抗原)与组织

24、或细胞标本中的抗原(抗体)发生反应。如组织或细胞中含有相应抗原(抗体)，二者结合形成的抗原抗体复合物中所带酶分子遇到底物时，催化底物产生显色反应，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原(抗体)的分布位置和性质；经图像分析也可达到定量的目的。EIHCT主要用于标本中抗原(抗体)的定位和定性检测，常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片等，最常用的酶是HRP，供氢体是DAB。与荧光免疫技术相比，EIHCT具有染色标本可长期保存。可用普通光镜和电镜观察结果。EIHCT可分为酶标记抗体免疫组化技术、非标记抗体酶免疫组化技术和酶免疫电镜技术三种类型。 酶免疫组织化学技术（EIHCT ）是在一定条件下，应用

25、酶标抗标记免疫技术课件标记抗体免疫组织化学技术1、直接法 用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应，形成抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，镜检。其技术要点：标本用0.3%H2O2和80%甲醇液处理15 min，消除内源性过氧化物酶，石蜡切片需常规脱蜡，用胰酶37消化，PBS洗涤；用10%牛血清白蛋白封闭15 min，即制得抗原片；加酶标记抗体，湿盒37温育30 min或4过夜，PBS洗涤；加底物显色，光镜下观察结果。该法具有操作简便、快速、特异性强、非特异显色低的优点，但一种酶标抗体只能检测一种特异性抗原，敏感性较低。2、间接法 用已知抗体（Abl）与标本中相应抗原（Ag）反应，形成Ag-Abl复

26、合物，加酶标记抗抗体（Ab2-E）反应，形成Ag-Abl-Ab2-E复合物，加底物显色，镜检。其技术要点：按直接法制备抗原片，加Abl（如鼠抗X），湿盒37温育30 min，PBS洗去未结合Abl；加酶标记抗抗体（如羊抗鼠Ig），湿盒37温育30 min，PBS洗涤；加底物显色，光镜下观察结果。间接法用一种酶标记抗抗体与多种特异性抗体结合，可检测多种抗原，实用性与敏感性均较直接法好。标记抗体免疫组织化学技术1、直接法 非标记抗体酶免疫组织化学技术原理酶标记抗体的方法，由于酶与抗体共价连接，抗体和酶的活性均受到一定的损害，若非特异性抗体同时被标记，将出现非特异性着色。非标记抗体酶法，是先用酶免疫动物，制备高效价、特异性的抗酶抗体，将酶与抗酶抗体结合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2）作桥，与抗酶抗体和组织抗原上的抗体（Ab1）结合，通过酶底物的显色反应检测抗原。非标记抗体酶免疫组织化学技术