miRNA研究的新思路课件

1、miRNA研究的新思路GeneCopoeiaTM 4006 020 200唐珍洁GeneCopoeia公司介绍日本Riken： 2004年1月-4月，为Riken提供1600个人类基因克隆构建。Roche： 2006年4月-2007年3月，合作完成13000个人类基因克隆的无细胞体系蛋白表达。NCBI ： 2009年成为NCBI推荐克隆供应商。中国科学院广州生物医药与健康研究院：2006年5月至今，慢病毒载体和哺乳动物载体干细胞相关基因表达克隆构建，华南地区特种疾病相关胚胎干细胞库的建立。上海生化所：2007年4月-2007年10月， 300多个人类激酶组shRNA表达克隆构建与确证。美国NI

2、H（美国国家卫生研究院）：2007年7月-2008年1月，3000个斑马鱼克隆构建。美国Novartis（美国诺华制药）：2009年10月，美国诺华制药签约长期基因克隆供应商。提纲miRNA的研究最新进展miRNA的文献计量分析miRNA研究的思路miRNA研究进展-表达调节miRNA研究进展-功能探讨miRNA的文献计量分析miRNA的文献计量分析-词频分析miRNA的检测方法NothernblotMicroarrayQuantitative Real-time PCR新一代测序qPCR的方法Loop反转录法Poly A 加尾法 1次RT可检测所有miRNA 通用性高； 适合miRNA的高通

3、量检测 经济、方便 每次RT只能检测1个miRNA 特异性高 多个样本中检测同一miRNA 价格较高miRNA qPCR 验证引物数据库人、小鼠、大鼠miRNA的Q-PCR引物都通过严格的实验验证/product/search/index.php?prt=22输入miRNA name、Acc No或Sequence等即可获得验证结果miRNA qPCR Detection kits Sensitivity以不同量（5g、1g、200ng、20ng、2ng、100pg）的人脑总RNA为模板检测hsa-miR-124的表达量，结果显示模板在5g100pg的总RNA范围内都能得到良好的线性扩增miR

4、NA表达量的高通量筛选高通量检测，不适合少量miRNA一般都为预制，做个性化芯片较难难区分高度类似结构的miRNA为半定量检测,检测动力学范围相对较窄假阴性、假阳性困扰Polay A 加尾法实现了高通量检测，定制灵活Array plate 采用了Ready-to-go 包装形式，使用简便利用了qPCR 检测的特异性及其灵敏度检测动力学范围可达7个数量级使用方式多样，可直接定购也可有交公司完成miRNA chipmiRNA qPCR ArraymiRNA Q-PCR Array Reproducility R2Test-1Test-2Test-3Test-4Test-11.0000 0.9922

5、 0.9939 0.9933 Test-20.9922 1.0000 0.9925 0.9928 Test-30.9939 0.9925 1.0000 0.9917 Test-40.9933 0.9928 0.9917 1.0000 All-in-OneTM miRNA qPCR Array 案例Differential expression of miRNAs in CRCmiRNA Bioinfo analysis内容：1：miRNA序列及同源性分析2：miRNA靶标的计算机分析相关数据库： miRBase： microrna.sanger.ac.uk PICTAR: TARGERSCAN

6、: miRNA function analysis功能获得研究：把miRNA导入到细胞，进行研究 miRNA mimics miRNA expression clones功能缺失研究：抑制miRNA的表达 miRNA 抑制剂 miRNA抑制剂表达克隆miRNA的靶标确证miRNA过表达试验-miRNA表达克隆miRNA表达框已完全测序确证 基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率 通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率使用案例-miRNA前体表达克隆 miRNA抑制表达试验-Mechanism of miRNA inhibitor

7、cloneAnalysis of the sub-cellular localization of TuD RNAsY4 scRNA: cytoplasmic RNA; ACA1 snoRNA: nucleolar RNA Un: untransduced cells；N: nucleus; C: cytoplasm5p: TuD-miR140-5p-transduced cells; 3p: TuD-miR140-3p-transduced cellsmiRNA靶标确证-靶标确证克隆构建的载体为含双荧光报告基因；萤火虫荧光素酶 （hLuc）同miRNA靶标融合表达，用于监控miRNA对靶标的

8、作用效果；海肾荧光素酶（hRLuc），可作为内参进行转染和表达效率检测miRNA靶标确证-单个靶标鉴定microRNAhLucTranslationLightNo Light使用案例- miRNA UTR target clone miRNA靶标确证-高通量筛选利用miRNA表达克隆和抑制克隆，结合免疫共沉淀进行高通量miRNA靶标确证miRNA靶标确证-高通量筛选miRNA expression clone trasfectionmiRNA inhibition clone trasfection细胞裂解免疫共沉淀提取复合物中的RNA进行定量PCR检测或者测序捕获复合物miRNA作用机制研究

9、-Knockdown experimentTransfection or viral deliveryshRNA or siRNAqRT-PCRqRT-PCR arrayWestern blotmiRNA作用机制研究- shRNA expression cloneRNA Polymerase III expression Pol III promoters (e.g. U6, H1) guaranteed knockdown even in difficult-to-transfect cellsmiRNA作用机制研究-Over-expression experimentCloningTran

10、sfection AnalysisTranscriptional assayWestern blot Localization（fusion tags）Expression SystemmiRNA作用机制研究- ORF克隆表达载体原核表达载体哺乳动物细胞表达载体慢病毒表达载体其他表达载体酵母/昆虫/无细胞miRNA Delivery病毒包装慢病毒（Lentivirus）稳定转染慢病毒颗粒侵染案例 慢病毒进入细胞后，病毒RNA逆转录后进入细胞核，并且稳定地插入到宿主基因组慢病毒包装试剂盒的应用GeneCopoeiaTM提供的产品和服务表达谱分析慢病毒转染系统功能研究作用机理 All-in-One miRNA qPCR Primer Array All-in-One miRNA qPCR 检测试剂盒 All-in-One miRNA Q-PCR 检测验证引物 miRNA q