分子克隆的步骤及原理

1、分子克隆的步骤及原理基本原理克隆开始前至少需要两个重要的 DNA 分子。首先，您需 要要克隆的 DNA 片段，也称为插入片段。它可以来自原核， 真核，灭绝的生物，也可以在实验室中人工创造。通过使用 分子克隆，我们可以更多地了解特定基因的功能。其次，你需要一个矢量。载体是用作分子生物学工具的 质粒 DNA ，用于制备更多拷贝或从某种基因产生蛋白质。质 粒是载体的一个例子，是由细菌复制的圆形，染色体外的 DNA。质粒通常具有多克隆位点或 MCS ，该区域含有不同限制 性内切核酸酶的识别位点，也称为限制酶。可以通过称为连 接的技术将不同的插入物掺入质粒中。载体质粒还含有复制 起点，使其可以在细菌中复

2、制。另外，质粒具有抗生素基因。 如果细菌整合了质粒，它将在含有抗生素的培养基中存活。 这允许选择已经成功转化的细菌。将插入物和载体克隆到宿主细胞的生物体中，最常用于 分子克隆的是大肠杆菌。大肠杆菌生长迅速，可广泛获得并 且具有许多可商购的不同克隆载体。真核生物，如酵母，也 可用作载体生物。一般分子克隆方法的第一步是获得所需的插入物，其可 以来自任何细胞类型的 DNA 或 mRNA。然后根据插入物的类 型选择最佳载体及其宿主生物，最终将用它完成。聚合酶链 式反应或基于 PCR 的方法通常用于复制插入物。然后，使用一系列酶促反应，将消化插入物连接在一起 并引入宿主生物体中以进行大量复制。从细菌中纯

3、化重复的 载体，并在限制性消化后，在凝胶上分析。然后将在凝胶上 纯化的片段送去测序以验证该奖章是所需的 DNA 片段。操作过程(1)DNA 片段的制备：常用以下方法获得 DNA 片段： 用限制性核酸内切酶将高分子量 DNA 切成一定大小的 DNA 片段；用物理方法(如超声波)取得 DNA 随机片段；在已 知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因 片段；从 mRNA 反转录产生 cDNA。(2)载体 DNA 的选择：质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子， DNA 呈环状， 大小为 1-200 千碱基对(kb) 。在细胞中以游离超螺旋状存在， 很容易制备。质粒 DNA 可通过转化引入寄主菌

4、。在细胞中有 两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具 有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型 载体一般只能携带 10kb 以下的 DNA 片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA 库和次级克隆。噬菌体 DNA ：常用的噬菌体的 DNA 是双链，长约 49kb，约含 50 个基因，其中 50%的基因对噬菌体的生长和 裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体 DNA 两端。中间是非必 需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。 载体系统最适用于构建真核生物基因文库和 cDNA 库。M13 噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有 F 基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。

5、M13DNA(RF) 在寄主菌内 是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。 寄主菌可分泌含单链 DNA 的 M13 噬菌体，又能方便地制备 单链 DNA ，用于 DNA 顺序分析、定点突变和核酸杂交。拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体 DNA 粘性末端顺序 的质粒 DNA 分子。是噬菌体质粒混合物。此类载体分子容 量大，可携带 45kb 的外源 DNA 片段。也能象一般质粒一样 携带小片段 DNA ，直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建 高等生物基因文库。(3)DNA 片段与载体连接：DNA 分子与载体分子连接是克 隆过程中的重要环节之一，方法有：粘性末端连接， DNA 片段两端

6、的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性 内切酶消化 DNA 可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下 可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。平头末端连接，用物理方法制备的 DNA 往往 是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头 DNA 片段可在 某些 DNA 连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端 高；同聚寡核苷酸末端连接。人工接头分子连接，在平 头 DNA 片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切 酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产 生粘性末端。连接反应需注意载体 DNA 与 DNA 片段的比率。以或 Cos 质粒为载体时，形成线性

7、多连体 DNA 分子，载体与 DNA 片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比 率常为 11。(4)引入寄主细胞：常用两种方法：转化或转染，方法 是将重组质粒 DNA 或噬菌体 DNA(M13) 与氯化钙处理过的宿 主细胞混合置于冰上，待 DNA 被吸收后铺在平板培养基上， 再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分 子的转化效率比非重组 DNA 低，原因是连接效率不高，有许 多 DNA 分子无转化能力，而且重组后的 DNA 分子比原载体 DNA 分子大，转化困难。转导，病毒类侵染宿主菌的过程 称为转导，一般转导的效率比转化高。(5)克隆的选择：直接筛选：有些载体带有可辨

8、认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。例如：有些噬菌体携带外源基 因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体 分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变 化，如蓝色变为无色；有些噬菌体能侵染甲菌而不能侵染 乙菌，携带外源 DNA 片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的 噬菌体均为重组分子。间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标 记基因，当外源 DNA 插入到抗药基因区后，基因失活，抗性 消失。如一质粒有 A 和 B 两个抗药性基因，当外源基因插入 到 B 基因区后，便只抗 A 药而不抗 B 药。因此能在 A 药培养 基上正常生长而不能在 B 药培养上生长的便是重组分子。核酸杂交：广泛用于筛选含有特异 DNA 顺