动物检验检疫新技术课件

1、动物检验检疫新技术 现代生物技术和现代信息技术的飞速发展及广泛应用，给动物检疫带来了深刻的影响，为动物疫病的诊断、检测、监测、处理等提供了更为快速、准确和高效的技术与方法。本次讲座简要介绍现代生物技术和信息技术基本类别与原理的基础上，重点分析现代生物技术和信息技术在动物检疫领域中的应用，并初步探讨现代技术检疫应用的未来发展。 现代生物技术及其发展现代生物技术以现代生物学作为理论基础，由生物学、免疫学、化学、物理学、信息学等多种学科理论和技术相互交叉融合而成，其发展与材料、信息、传感器、图像处理、微机电系统等多种技术的发展息息相关，因而现代生物技术已经突破传统生物学的范畴，成为研究现代生物学的必

2、备工具和重要手段。基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程 免疫血清学技术基础 分子生物学技术基础 抗原抗体反应 Reaction of Antigen and Antibody抗原抗体反应的基本原理？构象决定簇和线性决定簇2、比例性 抗原一般都是多价的，而抗体（IgG）则是二价的，只有二者比例适合时，抗原抗体才能结合得最充分，形成的抗原抗体复合物最多，反应最明显，结果出现最快，此称为等价带（zone of equivalence）。如抗原或抗体过多，则二者结合后均不能形成大的复合物，不呈现可见反应，称此为带现象（zone phenomenon），出现在抗体过量时，称为前带（prezone），

3、出现在抗原过剩时，称为后带（postzone）。 比例性示意图抗体过量比例合适抗原的量抗原过量抗体沉淀的量前带等价带后带4、分阶段反应 抗原抗体反应可分为两个阶段：第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。 5、敏感性 抗原抗体不仅有高度特异性，还具有较高敏感性，不仅可用于定性，还可用于检测极微量的抗原抗体，其灵敏程度大大超过当前应用的常规化学方法

4、。但反应的类型不同，其敏感性有很大的差异。反应的组成成分 1）抗原 2）特异抗体 3）环境因素 基本因素：0.85%NaCl作电解质 反应温度: 37或56 pH : 7.0 特殊因素:补体三、影响抗原抗体反应的因素四 、主要的抗原抗体反应1、凝集反应（Agglutination)2、沉淀反应(Precipitation)3、补体结合试验(Complement fixation test ,CFT)4、中和试验(Neutralization test)5 、免疫标记 表 抗原抗体反应的基本类 型 表反应类型 实验技术 检测方法 敏感度沉淀反应 液相沉淀试验 观察沉淀、检测浊度 +，+ 琼脂凝胶

5、扩散 观察扫描沉淀线或环 + 凝胶电泳技术 或峰或弧 +补体参与反应 补体溶血试验 以裸眼或光电比色仪 + 补体结合试验 观察测定溶血现象 +免疫标记技术 荧光免疫技术 检测荧光现象 + 放射免疫技术 检测放射性 + 酶标免疫技术 检测酶底物显色 + 发光免疫技术 测定发光强度 + 生物素-亲合素技术 结合其它标记技术 + 金标免疫技术 检测金颗粒沉淀 +凝集反应 直接凝集试验 用裸眼、放大镜或显 + 间接凝集试验 微镜观察红细胞或胶 + 凝集抑制试验 乳等颗粒和各种凝集 + 协同凝集试验 现象 + 抗球蛋白试验 +中和反应 病毒中和试验 病毒感染性丧失 + 毒素中和试验 外毒素毒性丢失 +

6、凝集反应（Agglutination) 颗粒性抗原（完整的细菌细胞或红细胞等）与其相应的抗体在适合条件下反应并出现凝集团块的现象。用于凝集反应中的抗原称凝集原(agglutinogen)。用于凝集反应中的抗体称凝集素（agglutinin)。(一)直接凝集试验玻板凝集反应试管凝集反应间接凝集反应示意图正相间接凝集试验(positive indirect agglutination test)用抗原致敏载体检测标本中相应抗体的方法反相间接凝集试验(Reverse indrect agglutination)用特异性抗体致敏载体,检测标本中相应抗原的反应,可用于检测乙型肝炎病毒表面抗原甲胎蛋白新型

7、隐球菌荚膜抗原等.间接凝集抑制试验(Indirect agglutination inhibition test)是以抗原致敏的载体及相应抗体作为诊断试剂,用于检测标本中是否存在与致敏载体相同的抗原的试验.若用已知抗体致敏的载体及相应的可溶性抗原作为诊断试剂,以检测标本中的抗体,此时称为反相间接凝集抑制试验间接血凝试验(indirect hemagglutination test)将可溶性抗原(或抗体)吸附于人的O型红细胞或绵羊家兔的红细胞制成抗原致敏的红细胞,与相应抗体(或抗原)作用,在有电解质存在的条件下,经过一定时间可出现肉眼可见的红细胞凝集现象.胶乳凝集试验(latex aggluti

8、nation)抗原(或抗体)与胶乳结合(致敏)后,直接与待测标本中抗体(或抗原)发生凝集反应,称为胶乳凝集试验.在猪萎缩性鼻炎的检测中应用较多。该试验的敏感性不及血凝试验.沉淀反应(Precipitation) 可溶性抗原（蛋白质、多糖或类脂）与其相应的抗体在合适条件下反应并出现絮状沉淀物的现象。用于沉淀反应中的抗原称沉淀原(precipitinogen)。用于沉淀反应中的抗体称沉淀素（precipitin) 。 环状沉淀反应(Ring precipitation test)原理:将抗原溶液叠加在细小玻璃管中抗体溶液上面,因抗血清蛋白浓度高,比重大,在两液交界的清晰界面上形成白色沉淀环为阳性反

9、应.技术要点方法评价:简便快速,但只能定性,敏感性低.Ascoli 反应 (1) 单扩散 * 过程： 制含抗体凝胶板打孔加系列稀释的标准抗原及待测抗原保湿、37OC、一天结果观察、计算（绘制标准曲线、计算待测抗原浓度,沉淀圈的面积与抗原含量成正比）。 *用途： 定性分析、定量分析。凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation)含抗体凝胶AgAgAgAg沉 淀 环 （2）琼脂双扩散双向免疫扩散实验又称琼脂扩散实验抗原抗体复合物沉淀线是半渗透性屏障。特异性的抗原抗体不会扩散通过沉淀线，但可允许其它抗原或抗体分子自由通过。因此，当抗原抗体存在多种系统时，即将出现多条沉淀线以至交叉反

10、应。从沉淀线的形状、位置及宽度，还可进一步了解两个反应物的相对浓度及扩散速度，而扩散速度与分子量呈反比，因此，也可间接了解反应物分子量的大小。双向双扩散沉 淀 带AbAgAbAg (3) 免疫电泳测定法 （immunoelectrophoresis） * 免疫电泳与扩散的结合 * 过程：先电泳（制板凝固前加玻棒打孔加抗原、指示剂电泳）再双扩散（取出玻棒制槽加抗体放入湿盒、37OC、扩散1天）结果观察。 * 用途：定性、纯度检察、不同组分分析。免疫电泳过程 * 过程：制板打孔加抗原、抗体电泳. * 用途：定性分析，普查。 * 优点：较双扩时间短（3090min）、检查样品多. 对流免疫电泳（co

11、unter immunoelectrophoresis）原理 当抗原和抗体在琼脂介质中电泳时，由于抗体的pH比较高，在适当的pH值下抗体带正电而抗原带负电，故在电场中抗体向阴极方向移动而抗原向阳极方向移动，直至相遇出现沉淀线。其原理与双向免疫扩散相同，但具有方法简便、快速及一次电泳可以检测多个品等特点。对流免疫电泳结果判定 第一次观察：从电泳槽取出琼脂板，对光观察抗原孔与抗体孔间是否有白色沉淀线，有沉淀线者为阳性，无沉淀线者为阴性。第二次观察：”琼脂板置湿盒中37保温数小时后观察。 如标本需保存可染色与保存。 注意事项 (1)本试验灵敏度高，有出现假阳性的可能，每次电泳均应设阳性对照、阴性对照

12、，对电泳结果沉淀线模糊不清的样品应重复实验。 (2)本试验中抗原和抗体的浓度应接近，如抗原浓度过高，可造成假阴性的结果，需将抗原稀释予以解决。应用(1)该试验适用于传染病和寄生虫病的快速诊断，如HBsAg的检测，血吸虫、包虫病等的抗体测定。样品多时可用大玻板。(2)本试验还可用于抗血清效价的测定，将抗血清作一系列倍比稀释，与抗原孔间出现清晰沉淀线的抗血清的最大稀释度为该血清的效价。火箭免疫电泳标 准 抗 原待 测 抗 原含 抗 体 凝 胶+ 有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素（红细胞的特异抗体）作指标系统的灵敏度很高的抗原抗体反应。 补体结合试验Complement fixation test

13、 ,CFT试验系统: 抗原 抗体 补体指示系统: 红细胞 溶血素 中和反应(Neutralization test)抗体使相应抗原（毒素或病毒）的毒性或传染性丧失的反应称为中和反应。 毒素或病毒种型的鉴定与抗原性分析抗毒素或中和抗体的效价滴定基本过程：抗血清与病毒混合经适当时间作用，然后接种于宿主系统以检测混合液中的病毒感染力。 例1 -NDV(新城疫病毒） 911d鸡胚 2448h鸡胚死亡 -NDV+抗血清 911d鸡胚 鸡胚不死亡例2 口蹄疫病毒(FMDV) 47d乳鼠 乳鼠死亡 FMDV+抗血清 47d乳鼠 乳鼠不死亡例3 FMDV 仔猪肾传代细胞(IB-RS-2)单层细胞 细胞病变(C

14、PU)：变圆、成串、空泡、变形、脱落、裂解FMDV+抗血清 IB-RS-2单层细胞 细胞无病变CPU用途：1.用已知血清检测病毒 鉴定病毒，诊断病毒病2.用已知病毒检测血清抗体 诊断病毒感染，测定病毒免疫血清效价（中和价）免疫标记技术 用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；借助荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定；可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；免疫标记技术在应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半

15、抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。免疫标记技术的分类根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为：免疫荧光技术放射免疫技术免疫酶技术免疫电镜技术免疫胶体金技术发光免疫测定免疫标记技术的应用范围近年来，随着基础免疫学、免疫化学、分子生物学、细胞生物学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。 免疫荧光

16、技术（Immunofluorescence technique)原理免疫荧光分析技术是一种以荧光物作为标记物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，可以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。 荧光素 荧光素是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即可引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止。可以产生明亮荧光的染色物质，称荧光素。常用的有：异硫氰酸荧光素(FITC) 四乙基罗丹明(RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC) 荧光抗体染色方法 直接法 用特异荧光抗体直接滴加于待检抗原标本上，由于标记抗原与抗体发生特

17、异性结合，使之呈现荧光，根据荧光分布和形态确定抗原性和部位。 间接法 可用于检测抗原和抗体。用未标记的特异性抗原加在切片上先与标本中之相应抗体(第l抗体)结合，再用针对第l抗体的抗抗体即第2抗体(荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在。 补体法 在抗原抗体反应时加入补体(多用脉鼠补体)，再用荧光标记的抗补体抗体(如抗C3)进行示踪。 荧光亮度的判断标准 “-”无或可见微弱荧光“+”仅能见明确可见的荧光“+”可见有明亮的荧光“+”可见耀眼的荧光。免疫酶技术一种把抗原抗体反应的特异性和酶催化底物的专一性有机结合起来的血清学方法。酶免疫测定的优点1）反应结果产生颜色，可用显微镜观

18、察结果。2）标本经酶标抗体染色后，还可用其他染料复染，显示细胞形态结构。3）标本可长久保存，随时备查。4）特异性强。5）灵敏度高。标记酶应具备的条件纯度高、高溶性、特异性强、稳定性高。测定方法应简单、敏感、快速。与底物作用后会呈现颜色。与抗体交联后，仍保持酶活性。最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（horeradish peroxidase,HRP)酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA的关键是利用抗原抗体的特异性吸附，在固相载体上像搭积木似地一层一层叠加（两层、三层或更多层）。最上面一层必须是酶标记物。整个反应必须在抗原抗体的最适条件下进行。ELISA的测定方法有直接法，间接法（用于测抗体），

19、双抗体夹心法（用于测抗原），竞争法（用于测小分子抗原及半抗原）等。直接法用于检测抗原或抗体，特别是总抗体浓度。1.不同浓度的抗原（或抗体）包被反应板2.封闭，洗涤。3.加酶标抗体（或抗原），洗涤。4.加入底物，测定。直接法间接法用于测定抗体1.抗原包被，孵育后洗涤2.封闭，孵育后洗涤3.加入待测样品，孵育后洗涤4.加入酶标二抗，孵育后洗涤5.加入酶底物，测定间接法包被洗涤加一抗即待检血清间接ELISA法检测抗体的方法步骤加酶标二抗洗涤洗涤加底物溶液显色加终止液结果判定双抗体夹心法用于测定大分子抗原纯化特异性抗体或特异性抗血清包被反应板，孵育后洗涤封闭，孵育后洗涤加入待测样品，孵育后洗涤加入酶标

20、特异性抗体，孵育后洗涤加入底物，测定双夹心法应用同双抗体夹心法，优点是不标记特异性抗体，缺点是复杂。1.纯化特异性抗体或特异性抗血清包被反应板，孵育后洗涤2.封闭，孵育后洗涤3.加入待测样品，孵育后洗涤4.加入第二种动物的特异性抗体，孵育后洗涤5.加入抗第二种动物特异性抗体的酶标抗体，孵育后洗涤6.加入酶底物，测定竞争法主要用于测定小分子抗原 1.纯化特异性抗体或特异性抗血清包被反应板，孵育后洗涤 2.封闭，孵育后洗涤 3.加入待测样品,再加入一定量的酶标记抗原(对照孔只加酶标记抗原),孵育后洗涤 4.加入底物，测定，颜色与抗原量成反比。斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附试验（DotELIS

21、A）是近年来建立的一项免疫酶新技术。以纤维素膜代替ELISA试验中常用的聚苯乙烯微量反应板。放射免疫标记技术 将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。放射免疫标记技术的特点RIA技术具有灵敏度高，可检测出ng(10-9g)至pg (10-12g) ，甚至fg (10-15g)的超微量物质。特异性强(可分辨结构类似的抗原)、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此、在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 其它免疫标记技术 免疫电镜技

22、术(Immune electron microscopy，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。 胶体金染色凝集素标记物 凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。常用的为植物凝集素有刀豆素A、麦胚凝集素、植物血激素、花生凝集素等。凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金

23、等结合、而不影响其生物活性，可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作。免疫印迹技术 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)或非变性电泳(NativePAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。Western blot method生物素与亲合素标记技术 生物素亲合素系统 (bi

24、otin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BAS的应用生物素亲合素系统（BAS）已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。 生物素(biotin) 生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄(型)和肝组织(型)，提取两型的生物活性基本相同，现已可人工

25、合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。亲合素 (avidin) 亲合素亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白亲合素与生物素间的亲和力亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka)为1015mol-1，比抗原与抗体的亲和力(Ka：105-11mol-1)至少高1万倍，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。亲合素富含色氨酸(约占6)，与其生物活性密切相关，因为亲合素是借助色氨酸残基与生物素的咪唑酮环结合。以结合1g生物素所需的亲合素量作为其活性单位，lmg纯的亲合素约含1315个活性单位。 发光免疫

26、测定法(Luminescent immunoassay) 将化学发光反应与免疫测定法结合起来的新型技术。 常用的发光试剂有鲁米诺（luminol)和光泽精(lucigenin)。发光免疫测定法优点1、可定量检测抗原或抗体。2、灵敏度高，约比酶免疫技术高1000倍。3、试剂稳定、无毒。4、检测操作简便、快速（半小时至数小时）。免疫检测技术的应用免疫检测技术以广泛应用于生物科学的各个领域。1、免疫疾病诊断2、动物植物生理活动研究3、物种及微生物鉴定4、动物、植物性状的免疫标记 5、免疫增强药物和疫苗的研究 6、发病机理研究 7、分子生物学研究 分子生物学技术基础分子生物学技术的飞速发展使动物疫病的

27、诊断和检疫迈上了一个新的台阶。常规的病原分离鉴定技术和抗原抗体的免疫学检测技术在动物疫病的诊断和检疫中发挥了极其重要的作用，愈来愈多的疫病建立了更加敏感特异的分子生物学诊断技术，动物疫病的诊断和检疫进入了对病原基因序列和结构进行直接测定的分子生物学水平。目前分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应、核酸杂交、寡核苷酸指纹图谱、限制性片段长度多态性、随机扩增多肽性DNA、脉冲电场凝胶电泳、DNA序列测定、DNA芯片、DNA生物传感器等。其中PCR和核酸杂交技术具有特异、敏感、快速、适于疫病早期诊断和大量样品的检测而成为分子生物学诊断技术中最常用和最具应用价值的方法。 聚合酶链式反应(PCR)在体

28、外利用耐热DNA聚合酶将少量DNA片段短时间内扩增数百万倍的一种方法。PCR方法具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、对检测材料要求低等优点而得到广泛的应用。目前在常规PCR方法的基础上根据应用目的不同又衍生出一系列改良PCR方法，包括反转录PCR、套式PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、兼并引物PCR、免疫PCR等。PrimerIPrimerIIAmplified target fragment基本原理和步骤包括：将模板DNA置高温下变性为单链，然后在较低温度下将人工合成的寡核苷酸引物与目的片段互补结合，DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物3端引人，沿模板53方向延伸，合成新的 DNA双链

29、作为下次循环的模板，如此以指数方式增加，经约30个循环使最初的模版DNA扩增数百万倍。寡核苷酸指纹图 该技术主要用于RNA病毒分析。原理:将提纯的病毒RNA，通过T1核糖核酸酶酶切，产生大小不同的片段，经放射性同位素标记后，进行垂直双相电泳，再经放射自显影获得特征性的图谱。该技术可很好地区别同一血清型或亚型的不同分离株，并可对病毒核苷酸序列进行半定量比较，因而对容易出现变异的病毒鉴定很有价值，尤其是在鉴定新出现或重新出现的病毒株上有很重要的应用价值。限制性片段长度多态性 是将限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术和杂交技术相结合而建立的一种检测技术。原理：首先利用限制性内切酶消化DNA，通过凝胶电泳

30、形成酶切图谱，然后转印至膜上，利用制备的探针进行杂交，从而鉴定出不同生物间的关系。该方法具有稳定性好、敏感性高，可进行同种内不同个体的鉴别。核酸杂交 基本原理：碱基互补的两条单链核酸经退火后形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的标记探针和待检测样品中的核酸。标记的核酸探针必须具有高度特异性，通常用检测病原的特异序列核酸片段进行标记。核酸探针的种类包括基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。标记物主要有放射性标记物(如32P)和非放射性标记物(如地高辛)。核酸杂交具有敏感、特异，可同时检测大量样品的优点，因而在疫病诊断和检疫中也得到广泛应用。根据核酸性质和支持介质的不同，主要有点杂交(Dot-blotting)、DNA印迹杂交 、RNA印迹杂交、原位杂交。随机扩增多态性DNA 该技术应用一个随机引物(通常10个碱基)对待检测DNA进行非特异性地扩增DNA片段，然后在凝胶电泳上观察扩增片段。该法操作简单，不需设计特异引物，用一个引物即可扩增出一系列片段，适于对未知DNA序列的基因组进行分析。但本法重复性稍差 脉冲电场凝胶电泳 该技术是20世纪80年代中期发展起来的一种新的电泳技术