医学细胞生物学-2015-第二次课课件

1、问题一 下面的图片是在哪种显微镜下观察到的结果问题三：如果想知道某一中蛋白质在细胞中的分布和不同组织中表达量的差异，如何设计实验？问题二：细胞系培养过程中一般包括哪些环节？第二章 细胞生物学的研究方法第一节 显微镜技术第二节 细胞的培养第三节 细胞的分离和细胞组分的分离第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术第五节 细胞功能基因组学研究技术第六节 生物大分子的结构测定第三节 细胞的分离和细胞组分的分离一 细胞的分离1 利用物理和生物学特性可简单有效地分离和筛选细胞 利用细胞的生长特性分离 利用细胞的密度特性分离 7从血液、体液中分离细胞血细胞白细胞血小板红细胞粒细胞单个核细胞淋巴细胞单核细胞B淋巴

2、细胞T淋巴细胞（CD8+和CD4+）8从血液中分离细胞采血方法：人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；小动物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。兔 耳静脉或动脉穿刺取血。 10细胞分离技术-从血液中分离细胞血中单个核细胞的分离： 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。 淋巴细胞分离液12细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞血中单核细胞的分离： 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离单个核细胞悬液多将悬液放入12cm直径的培养皿中，于37培养箱中静置30-60min。此时单核细胞贴壁，而淋巴细

3、胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用Hanks液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下未贴壁细胞（淋巴细胞）。 用Hanks液强力冲洗吹打与震荡，将贴壁的单核细胞冲落或用刮刀轻刮，收集贴壁的单核细胞。 计数后分别制备所需浓度的细胞悬液。磁性氧化物核心（Fe3O4）聚合物层（聚苯乙烯或聚氯乙烯等高分子材料）15细胞分离技术-从血液中分离细胞 免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。 通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶

4、细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。17细胞分离技术-从血液中分离细胞 免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞(CD34)、单核/巨噬细胞(CD14)、胰岛细胞(胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）) 、多种肿瘤细胞等。T淋巴细胞已致敏抗体的免疫磁珠荧光抗体19细胞分离技术-从血液中分离细胞20细胞分离技术-从血液中分离细胞21细胞分离技术-从血液中分离细胞22细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞MACS技术优点：稳定、高质量的分选：纯度（90-99%）对细胞无损伤操作简便、快速：消毒方便，

5、手动分选30分钟内完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1011个细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及mRNA。MACS技术缺点：分离效率较流式细胞仪分选略低且耗材相对较贵，适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。只适用于简单标记的细胞分离24细胞分离技术-从血液、体液中分离细胞流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞

6、：从血液、体液中分离细胞血细胞白细胞血小板红细胞粒细胞单个核细胞淋巴细胞单核细胞B淋巴细胞T淋巴细胞（CD8+和CD4+）制备细胞匀浆细胞匀浆液膜细胞器大分子 方法：低渗透压 超声振荡 在细胞膜上打孔 强制通过微孔 机械破碎或研磨二 细胞组分的分离和纯化二 细胞器及细胞组分的分级分离1 差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒2 速度沉降分离沉降系数不同的颗粒3 平衡沉降分离密度不同的颗粒密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心（density gradient centrifugation）：将待分离的细胞组分铺放在不连续介质表面或内部，离心使细胞不同组分以不同速率沉降，形成不同沉降带。类型：速度沉

7、降；平衡沉降。常用介质：蔗糖、多聚蔗糖、 甘油、氯化铯 。密度+2 速度沉降（velocity sedimentation）用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器原理：制备梯度离心介质（密度由顶部到底部逐渐增加）,分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降，形成不同的沉降带而达到分离。梯度特点:梯度平缓，密度较低( 5%-20%)，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。分离效率: 取决于沉降系数间的差异。速度沉降平衡沉降3 平衡沉降（equilibrium sedimentation）用途：分离大小、形态相似而密度不同的组分。特点：（1）介质密度较高，陡度大(20%-70%） ，介质的

8、最低密度应大于被分离组分的最大密度。（2）所需的力场通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。分离效率: 取决于浮力密度间的差异速度沉降平衡沉降速度沉降：大小和形状平衡沉降：浮力密度CsCl平衡沉降证实DNA半保留复制（1957， Meselson，Stahl ）15N/15N-DNA15NH4Cl溶液14NH4Cl溶液15N/14N-DNA14N/14N-DNA15N/14N-DNA三 蛋白质的分离与鉴定1 层析的方法纯化蛋白质2 电泳的方法分析、

9、鉴定蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的不同等电聚焦电泳等电点的不同双向电泳分子量和等电点的不同离子交换层析电荷的不同凝胶过滤层析分子大小的不同亲和层析形状离子交换层析：是一种根据被分离物质的分子表面电荷性质来分离的吸附层析。将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Sha

10、pir0建立，其原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N，N 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。等电聚焦电泳(IFE）利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3） 加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度 加样品，然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后（）（）（）（）高p

11、H高pH低pH低pHC 双向电泳第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异，垂直方向反映出它们在分子量上的差别。第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳第二向电泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3四 核酸的分离纯化与鉴定1 差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法2 凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法细胞化学技术（Cytochemistry）：在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研究细胞和细胞内的细胞器的结构、功能关系的一种技术。第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术第四节 细

12、胞化学和细胞内分子示踪技术一、酶细胞化学技术二、免疫细胞化学技术三、放射自显影技术四、细胞示踪技术与应用（GFP）一、酶细胞化学技术 通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。二、免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry） 利用抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性的特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法。常用的标记方法：1)荧光标记：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明2)酶标记：辣根过氧化物酶（HRP）3)铁蛋白标记：铁蛋白是含铁离子的蛋白质，在电镜 下铁离子可显黑色4)胶体金标记：即金的水溶液，具有一般溶液的特 性，用它与抗体标

13、记后，经抗原抗体 反应可定位抗原的存在。免疫铁蛋白电镜技术免疫胶体金电镜技术 免疫荧光显微镜技术（Immunofluorescence microscopy）荧光素标记抗体的方法： 直接法：荧光素直接和第一抗体相偶联 优点：简单方便，易于操作，省时省力 缺点：敏感度不够，特异性不强，标记抗体需自己制备间接法：荧光素先和第二抗体（抗第一抗体的抗体）偶联，再 与第一抗体作用 优点：敏感度高，特异性强，可购买不同的标记二抗 缺点：操作比直接法复杂三、放射自显影术(autoradiography) 放射性核素在蜕变过程中发出带电粒子可使感光材料感光。利用这样的特性，用放射性化合物脉冲标记活细胞,经固定

14、、切片后在暗处把感光乳胶覆盖于切片上,在此期间,由于放射性同位素衰变使乳胶曝光(卤化银还原成银离子),经显影、定影,根据银粒所在部位,就可知道细胞中放射性物质的分布。将放射性化合物渗入活细胞固定，制备光、电镜切片感光乳胶覆盖于切片上自显影和定影存放数日，放射性同位素衰变，使乳胶中的卤化银还原成银离子根据银盐颗粒的位置确定放射性物质的分布例如，用放射性前体3H-胸苷，3H-尿苷显示DNA和RNA合成和保留的位置67细胞示踪技术与应用 (green fluorescent protein ,GFP)68主要内容GFPGFP的研究历史GFP的应用学习要点基本特性机遇与重视开阔视野69GFP 基本性状

15、70简介绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP最早是由下村修等人在1962年在水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。 由水晶水母（Aequorea victoria）中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm71分子结构 238aa,单链 ;二聚体, -桶状结构;单体：11个-折叠包围一个-螺旋；-桶状结构直径约3nm，高约4nm，规则的氢键带 ；其末端的短螺旋以及环状结构一起组成一个单独的致密结构域 ；72发光机制 生色基团附着于-螺旋上，几乎完

16、美的包被于桶状结构中心。六肽组成的发光中心发光团（三肽）Ser65-Tyr66-Gly67经过环化形成了对羟基苯咪唑啉酮。自身催化环化的结果有氧过程，O2使Tyr66脱氢氧化。73特点GFP荧光极其稳定；中度氧化剂对GFP荧光影响也不大；灵敏度高,抗光漂白能力强；荧光的产生不需要任何外源反应底物。74GFP的研究历史 从下村修到钱永健75The Nobel Prize in Chemistry 2008for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFPOsamu Shimomura Martin Cha

17、lfie Roger Y. Tsien 钱永健 马丁查尔菲 下村脩 2008年10月8日 76下村脩（1928年8月27日），有机化学家、海洋生物学家1928年生于日本京都，1960年获得日本名古屋大学有机化学博士学位美国Woods Hole海洋生物学实验室（MBL）波士顿大学医学院名誉退休教授 77小海萤（Cypridina hilgendorfii）1955, Nagoya University, laboratory of Prof.Yoshimasa Hirata.78Friday Harbor, 1961.Aequorea victoria Prof.Frank Johnsons L

18、ab, Princeton, NJ, 195979Shimomura O, Johnson F, Saiga Y (1962). Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59: 22339 水母素aequorinGFP80600 rings per hour（ 10 times more than by hand.）3040 bucketfuls of je

19、llyfish each day. 1 mg of AF-350 150 mg of purified aequorin 50,000 jellyfish.2004811974年，纯化到了这个蛋白， 时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。 同年，荧光共振能量转移(FRET)在生物中发现“荧光素GFP ”1979年，GFP的发色基团确定 酶解法 821992年，Douglas Prasher拿到了GFP的基因（Woods Hole海洋研究所）(Douglas Prashers) work was critical and essential for the work we did in our

20、 lab. They couldve easily given the prize to Douglas and the other two and left me out. Martin ChalfieIm really happy for them. I was really surprised that particular topic carried that much weight . Douglas Prasher83马丁查尔菲（Martin Chalfie，1947年），美国科学家成长于美国芝加哥1977年获得美国哈佛大学神经生物学博士学位1982年起任美国哥伦比亚大学生物学教授

21、。 84Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., and Prasher, D. C. (1994), “Green fluorescent protein as a marker for gene expression,” Science 263: 802805.85钱永健Roger Yonchien Tsien（1952年2月1日）美国生物化学家美国国家科学院院士美国国家医学院院士美国艺术与科学院院士圣地牙哥加利福尼亚大学生物化学及化学系教授。1972年，哈佛大学化学及物理学最优等学士学位。1977年，英国剑桥大学生理学博士学位。1

22、977年-1981年，剑桥大学研究员。8687“当然，我希望各个国家的年轻人都能受到激励，但我知道，中国人对此会尤其感到骄傲”。 “可能因为我是华裔，很多中国人可能受到很大鼓舞，希望更多的中国年轻人也投身到基础理论研究中来。” “我是在美国出生长大的，我不是中国科学家我的得奖有中国人高兴，如果这样让很多年轻人对科学发生兴趣，这是很好的事。”88GFP的应用1、骨架和细胞分裂 ；2、细胞器动力学和泡囊运输 ；3、发育生物学 ；4、神经生物学 ；5、其他应用 ；89细胞骨架actintublin拟南芥胚轴微管- GFPA hairy root of Medicago truncatula expr

23、essing a GFP fusion to the microtubule 90细胞分裂GFP-tubulin 91细胞器动力学和泡囊运输Treatment of stable HeLa cells expressing EGFP-LC3 with an autophagy-inducing small molecule increases the formation of autophagic vesicles (EGFP-positive punctate structures). Sarkar et al, Nat Chem Biol, 3(6):331-338 (2007).92发育

24、生物学Long term 4D imaging of Caenorhabditis elegans embryo93神经生物学9495构建表达绿色荧光的菌株FRD1-GFPgfppMRP9-1电击转化FRD1FRD1-GFP96构建表达绿色荧光的菌株FRD1-GFPFRD1明视场观察 激发荧光观察 97Thanks！第四节 细胞功能基因组学研究技术一、基因表达的定量分析二、基因表达的上调和下调技术三、蛋白质相互作用的研究技术四、蛋白质与核酸相互作用的研究技术五、生物芯片技术六、蛋白质组学技术七、高通量测序技术一、基因表达的定量分析1 印迹杂交技术是定量检测基因表达的基本方法2 原位杂交可提供基

25、因表达的时空信息3 荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的 常规方法Northern印迹分析特异性mRNAWestern印迹分析蛋白质分子核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization 核酸分子杂交 （nucleotide molecular hybridization）以DNA的变性、复性为理论基础；指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。 Southern印迹（Southern blot） 基本操作过程待测DNA样品制备、基因探针标记；

26、待测DNA样品的电泳分离；电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物；特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。 Southern blot基本流程电泳 转移 杂交，显影酶切DNA样品上样 DNA印迹重物Southern blot关键步骤 待测DNA样品的酶切消化 基因组DNA进行消化，才能在电泳过程 中将不同长短的DNA片段分离开。 基因探针的标记 探针序列和探针信号的选择。要考虑 特定基因的重复性、保守性和稳定性。 可用同位素和非同位素标记。 Northern 印迹（Northern blot） 是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mR

27、NA的常用方法。 注意事项：RNA易被酶降解。 可用于分析基因转录水平的变化 。Western blot （蛋白免疫印迹）技术 是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印到化学合成膜的支撑物上，利用特异性抗体进行反应，定性分析蛋白质。 用于分析基因表达(蛋白水平）的变化。一抗一抗一抗(兔抗Actin) 曝光后的蛋白条带二抗 (辣根酶标记的羊抗兔IgG)ECLX光片曝光显影ECL 试剂含有转印蛋白的PVDF膜 +转印膜上蛋白检测示意图 WB结果分析原位分子杂交技术 利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术。 组织、细胞或染色体的固定； 探针； 与探针结合的标记物； 可用于基因及其表达产物的

28、定位分析。聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由K. Mullis于1983年建立；1999年获诺贝尔化学奖。可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析；PCR 体系模板引物耐热DNA聚合酶dNTPs含Mg2+的缓冲液PCR的过程变性(Denaturing) 95DNA模板变性成为单链，引物自身和引物间的局部双链消除退火(Annealing) 引物与模板DNA杂交，Tm值减5延伸(Extension) DNA聚合酶在72催化DNA的合成i

29、ngPCR技术的工作原理117PCR技术 PCR分析已知基因；反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将RNA的反转录和PCR联合应用的一种技术。 RT-PCR是从组织或细胞中获得目的基因及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的有效方法。 RT-PCR与PCR区别 模板为mRNA 需逆转录酶 产物为cDNA119mRNA 5AAAAAA(n) 3mRNA 5AAAAAA(n) 3TTTTTT(n) 5mRNA 5cDNA 3AAAAAA(n) 3TTTTTT(n) 5AAAAAA(n) 3TTTTTT(n) 5oligo(dT)12-18反转录酶RN

30、ase HDNA 聚合酶S1 核酸酶3cDNATTTTTT(n) 5AAAAAA(n) 3TTTTTT(n) 5反转录合成cDNA 实时、定量PCR技术 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程。通过标准曲线对样品中的DNA的起始浓度进行定量的方法。 特点：对DNA/RNA模板定量，灵敏度强，特异性高。121实时、定量PCR技术QR3355上游引物下游引物荧光标记引物RQ 3355DNA序列测定DNA SequencingDNA序列分析方法双脱氧链终止法 利用2，3 -双脱氧核苷酸掺入中， 终止化学反应化学裂解法 利用化学试剂裂解修饰碱基终止聚合反应 戊 糖（RN

31、A）12345核糖(ribose)（DNA）脱氧核糖(deoxyribose)DNA的序列测定5端3端CGA126双脱氧链终止法dADNA自动测序用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA序列自动分析ddG红ddTddA绿ddC蓝橙毛细管电泳荧光标记DNA合成测序结果展示DNA自动测序结果举例DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异通过DNA序列测定分析人工重组的基因

32、通过DNA序列测定对定点突变进行确认 DNA芯片技术DNA Chip Technologies DNA芯片（DNA chip） 也称DNA微阵列(DNA microarray)在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息； 包括cDNA芯片和寡核苷酸微阵列基因芯片工作流程DNA芯片技术cDNA芯片 探针是cDNA片段，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。寡核苷酸芯片 基因特异的寡核苷酸片段为探针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。 可进行高通量基因转录活性的分析DNA芯片

33、技术的特点 快速、高效、敏感、平行化、自动化。 通过芯片技术筛选得到的表达信息还要用Northern blot或定量RT-PCR进行验证DNA芯片技术的应用 肿瘤基因表达谱的差异研究； 基因多态性分析； 微生物筛选鉴定； 遗传病产前诊断等 蛋白质芯片和组织芯片蛋白质芯片 蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 组织芯片 是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术 蛋白质检测芯片 是将成千上万种蛋白质如抗原、抗体、受体或酶在固相载体表面高度密集排列构成探针蛋白点阵，然后依据蛋白质分子间或蛋白质与核酸间相互作用的原理与待测样品杂交，实现高通量的检测和分析。 蛋白质芯片技术优势 在蛋白质结构、功能

34、和相互作用，以及疾病发展过程中蛋白表达谱差异研究等方面。 在临床医学研究中，利用蛋白质芯片技术寻找新的肿瘤标记物，各种肿瘤标记物的筛选，用于早期诊断和治疗效果的监测。 组织芯片 应用成百上千的处于自然或病理状态下的组织标本，同时研究一个或多个特定基因及其表达产物的技术。 将组织标本集成在一张固相载体上形成微缩组织切片，在组织切片上高通量获取基因的表达信息。 应用：肿瘤病理学（病因、诊断、肿瘤标记物筛选、治疗等）基因表达的上调和下调技术1 外源基因在细胞中的过表达是上调基因表达 的主要方式2 RNA干扰是下调基因表达的主要方式RNA干扰的研究进展一. RNAi简介二. RNAi作用机制三. RN

35、Ai的生物学功能五. RNAi展望四. RNAi应用一、RNA干扰的简介 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式，它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股RNA（small interfering double strand RNA，siRNA)诱导产生的一种转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象。1990年，Jorgensen等将产生色素的基因导入矮牵牛中，试图加深花朵的颜色，结果很多花没有变成深紫色，反而成了花斑的甚至白的。表明不仅导入的基因未表达，而且本身同

36、源的基因失活。从而发现在转基因植物中存在基因表达的共抑制现象，即转入的外源基因和本身的同源基因都被抑制，出现基因沉默现象。父本转基因后代1998年Fire等证实，将制备的RNA高度纯化后发现，单链RNA的基因抑制作用很微弱，而用纯化后的dsRNA却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量级，他们称此现象为dsRNA介导的RNA干扰。2002Science杂志评为“2002年的重大突破” 2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine 二.RNAi作用机制起始阶段效应阶段扩增扩散阶段siRNA

37、的形成 沉默复合物(RISC)的形成 RdRP扩增dsRNA 当dsRNA进入细胞, 被Dicer酶复合物所辨认，并将其酶解为siRNA。siRNA随后与蛋白复合物RISC结合，RISC被激活的同时伴随着siRNA双链解螺旋。单股的siRNA引导RISC结合到靶mRNA上，利用RISC上核酸酶活性将靶mRNA酶解。在某些生物的细胞中，siRNA 是非卷曲的，可结合到靶mRNA上并且作为RDRP的引物。RDRP扩展该引物，将mRNA转变为双股致使其能够被Dicer酶解，这样诱导开始一个新的siRNA产物循环。起 始 阶 段扩 增 阶 段效 应 阶 段 主要特征：只对exon有效，对intron和

38、promoter无效RNAi具有很高的特异性放大性 RNAi的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持三. RNAi的生物学功能3.1 RNAi抑制转座子活性 研究显示：蠕虫mut-7基因参与RNAi并且与转座子的转座抑制有关；在果蝇中，参与RNAi的RNA解螺旋酶Spindle-E的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失。同时提高了反转录转座子活性。由此可见，RNAi参与转座子转座的抑制。 三. RNAi的生物学功能3.2 RNAi抵御病毒感染 在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现，sgs2sdel基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性 。而且在被病毒感染的植物细胞中，病毒

39、通过自身进化的基因阻碍RNAi的产生。 Novina等合成分别针对HIV-1细胞受体CD4、病毒结构蛋白Cag基因的siRNA，发现siRNA能够有效抑制HIV-1进入细胞。 3.3 RNAi参与异染色质的形成和遗传 研究表明，着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并共同促使异染色质组装成核。 异染色质的遗传需要RNAi，它引导细胞周期中DNA复制时组蛋白的改变。 三. RNAi的生物学功能4.1 基因敲除 RNAi能使在体外培养的细胞达到基因敲除的效果, 对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因, 可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。如Van Brocklyn等应用RNAi技术敲低神经鞘氨醇激酶(SphK1)表达, 显著减少恶性胶质瘤细胞系的增殖率; 而且, 在敲低SphK2表达时更能抑制恶性胶质瘤细胞系的增殖。 四. RNAi的应用4.2基因功能的研究借助RNAi技术可以迅速简便的干扰细胞中某个基因的表达，分析该基因缺失后对细胞产生的影响，从而研究目标基因的功能。 4.3 基因治疗人们把siRNA 技术引入到c-myc功能的研究中,通过体外合成的c-myc-siRNA 抑制急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞的c-myc表达活性, 成功地抑制了Jurkat细胞的增殖。