梁光义 抗乙肝一类新药y101的研究

1、抗乙肝一类新药Y101的研究 梁光义 刘昌孝 黄正明 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 天津药物研究院 中国人民解放军第302医院 贵州百灵制药 概述： 乙型肝炎的危害是世界性的问题，特别是亚非国家病毒携带人群比例极高，中国约占总人口的8%，据国家卫生部2009最新调查公布，在中国，乙肝病毒携带者已高达亿,其中乙肝患者已达到2200万，每年发生癌变的患者超过300万，而死于肝癌患者更超过160万。 现有抗肝炎病毒药物的现状 尽管用于治疗乙肝的药物种类众多，但至今尚没有一种理想的治疗药物。 核苷类药物拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦酯等药物容易导致病毒变异和停药后反跳。 干扰素对乙肝的治愈率低

2、，而复发率较高，且价格昂贵（每一疗程约需24万元），临床难以广泛使用。 中药有效成分甘草次酸、齐墩果酸、水飞蓟宾等疗效不显著。 本研究组从1993年起，对贵州省的治疗肝炎的民族药进行了较为系统的筛选，选择了治疗肝炎用的小花清风藤、尖叶清风藤、四川清风藤、册亨清风藤、叶下珠、姜黄、甘草和栀子等10多种中药民族药进行了抗乙肝活性成分的广泛研究。 Dichondra repens Forst. 马蹄金 苗药马蹄金为旋花科植物，归肝经，用于治疗黄疸、水肿，（贵州省中药材、民族药材质量标准2003版）民间用于治疗肝炎，是苗药金马肝泰胶囊的君药。 1999年国家自然科学基金 “民族药马蹄金生物活性成分的研

3、究”，（批准号：39960081）。 马蹄金素（Repensine）dipeptide derivatives with anti-HBV activity 发现在苗药马蹄金中的马蹄金素，有抗乙肝病毒作用，且具有二肽结构。抗乙肝活性（国家新药筛选中心）Concentration (mol/mL)Inhibiting HBV in 2.2.15 cell lineHBsAgHBeAg马蹄金素0.149.0 %20.0 %Aciclovir 0.452.9 %44.2 %比阿西络韦作用强，无细胞毒作用，新结构类型2002年申请专利。 马蹄金素专利 (ZL 02 160309.X) ，2005 马蹄

4、金素的深入研究：在独特的二肽结构基础上合成一系列衍生物。 100 衍生物11马蹄金素衍生物的合成路线：12序号取代基R1R2R3R41HHHCOONa2HHHCOOCH33HH4-OHCOOCH344-OHHHCH2OH5H3-CH3HCH2OH64-NO2HHCH2OH7H2-ClHCH2OH8H3-CH3HCOOCH39H2-ClHCOOCH310H2-Cl4-OHCOOCH3部分已合成的马蹄金素衍生物结构：13序号取代基R1R2R3R411HH4-O-EtCOOCH3124-NHAcHHCH2OAc134-NHAcHHCH2OH144-NO2HHCOONa154-NO2HHCOOCH31

5、6HH4-O(CH2)3CH3COONa174-NHAc4-CH34-OCOCH3COOCH318HH4-NHAcCH2OH194-OCH2COONaHHCH2OH204-NHCOCH2CH2COONa4-ClHCH2OH部分已合成的马蹄金素衍生物结构马蹄金素衍生物体外抗乙肝病毒筛选试验细胞培养2.2.15细胞消化,吹打 1:3传代细胞计数长成单层后实验马蹄金素衍生物体外抗乙肝病毒筛选部分结果compoundTC50(g/ml)抑制DNA复制IC50(g/ml)SI117.81 0.6328.272450.67 51.788.70377.04 25.193.06428.74 1.0228.29

6、553.42 1.1645.936587.06 103.255.697198.46 48.504.098346.68 105.883.279240.38 52.004.6210396.81 95.984.13compoundTC50(g/ml)抑制DNA复制IC50(g/ml)SI1189.23 24.203.691243.11 0.8252.571353.42 4.9610.7814451.20 59.487.5915358.02 53.126.7416388.03 13.1229.5717388.03 6.6258.6118577.35 87.506.6019160.25 13.5111.

7、8620257.31 54.284.74马蹄金素衍生物体外抗乙肝病毒筛选部分结果compoundTC50(g/ml)抑制DNA复制IC50(g/ml)SI21574.76 68.708.3722388.03 4.5685.0923129.34 1.4390.452480.13 2.3933.532514.37 0.3442.262686.23 11.677.3927388.03 2.41161.012886.23 7.2811.842964.15 7.049.113078.52 6.9811.25马蹄金素衍生物抗乙肝病毒体外筛选部分结果化合物TC50(g/ml)抑制HBsAg抑制HBeAg抑制

8、DNA复制IC50(g/ml)SIIC50(g/ml)SIIC50(g/ml)SI3150025.1919.85-32.9615.232*388.03 33.51 11.5813.5128.722.4158.603386.23 -9.598.9934388.03 150.202.58-27.2814.22351000-252.603.963686.23 -1.4459.9737130.56 -10.5612.363843.11 -1.8123.8239388.03 -25.0015.523TC786.00 -18.9041.59马蹄金素衍生物抗乙肝病毒体外筛选部分结果*32 Y10119Y10

9、1临床前研究路线：马蹄金素衍生物Y101获得临床试验批件药学研究药效学研究安全性评价药代动力学研究综合评价研究技术路线：20 1、候选药物Y101的药学、质量标准及稳定性初步研究结果： 比较了8条合成路线，确定并优化了Y101的化学合成工艺：8 kg左右（含量 99%，单一杂质含量 0.2%），Y101全合成原料及试剂价廉易得、工艺简单，反应条件温和、总产率较高，适合大规模制备。 Y101的合成工艺优化结果（总收率：36%） 化学药物杂质研究的技术指导原则 指导原则编号【 H】G P H 3 - 1最大日剂量报告限度鉴定限度质控限度2g0.05%0.10%或 1.0mg （取最小值）0.15%

10、或 1.0mg （取最小值）2g0.03%0.05%0.05%检查项目/批号200912012009122920100104-220100106-3备注熔点（）177.4-178.1177.3-178.3176.7-177.1177.3-178.2比旋度-63.18-62.48-62.52-63.79干燥失重0.05%0.22%0.35%0.42%0.5%有关物质0.69%0.53%0.33%0.25%单个有关物质20 20 20 20 2045 i) 体内代谢稳定性预试验：目前已经建立了通过LC/MS/MS测定Y101原型药物和代谢产物的分析方法；初步发现了6个主要体内代谢产物；初步测定了Y

11、101的体内代谢半衰期为3个小时左右。Y101的体内代谢产物初步研究结果Y101研究小结： Y101体内外试验表明，Y101对HBsAg、 HBeAg 、DHBV-DNA均有有明显的抑制作用，无明显反跳，能有效的清除细胞内cccDNA，并且具有保肝作用，对人P450同工酶没有抑制作用，绝对生物利用度达到64.10%。半衰期3小时。 目前正在进行Y101的长毒等试验。 Y101具有较好的抗乙型肝炎病毒药物开发应用前景。 马蹄金素计算机药物分子辅助设计实验值与预测值相关图（training set）以COOCH3类为例观察取代基对化合物活性的影响：H-bond donor(-0.00250.002

12、5)Positive: Light blue; negative: Light orangeHydrophobic/non-polar(-0.0150.015)Positive: Green; negative: PurpleCombination effect(-0.0150.015)Positive: blue; negative: redCOMFA结果，其中左图为R1与R2部分，右图为R3部分。Green(+) - Yellow(-) Steric (立体效应)Blue(+) - Red(-) Electrostatic（静电效应）HBV聚合酶蛋白模型在Swiss model服务器上进行

13、三维构型预测，所得HBV的活性区域的三维结构如下图所示。 对于COOCH3类化合物来说，Electron withdraw: R1的3位、R2的4位和R3的4位增加吸电子基团有利于活性提高，而R1的4位增加增加吸电子基团则不利于活性的提高。Hbond donor: R3的4位在连接的第一个原子上连有氢键供体的O,N等不利于活性提高，但R2的4位和R3的4位如果在连接的第二个原子上连有氢键供体则有利于活性的提高。Hydrophobicity: R1的4位、R2的2、3位增加疏水性有利于活性的提高。结合构效关系的结果，进行马蹄金素衍生物合成 合成500多个马蹄金素衍生物，寻找更好的抗HBV的目标化

14、合物。 Y101专利与资助 1、N-(N-苯甲酰基-苯丙氨酰基)-苯丙氨酸二肽衍生物及其制备方法和用途, 专利号：200610201016.4 2、苯丙氨醇类化合物作为制备治疗乙肝药品的应用及其制备方法。专利号：02160309.X 3、PHENYLALANINE DIPEPTIDE DERIVATIVES, COMPOSITION AND USE THEREOF , USP 12/056.506 论文：Synthesis and anti-hepatitis B virus activities of Matijing-Su derivatives ，Bioorganic & Medicin

15、al Chemistry，2009，17：3118-3125Article title: Synthesis and biological evaluation of Matijing-Su derivatives as potent anti-HBV agents，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2009，11,5352-5360 另有4篇中文核心期刊论文发表。资助：1、科技部国际合作项目，抗乙型病毒性肝炎新药Y101的研究开发，项目编号：2008DFB30110 2、国家十一五“重大新药创制”科技重大专项，以马蹄金素为先导化合物的新型抗乙型肝炎病毒候选药物研究，项目编号：2009ZX09103-0793、国家十二五“重大新药创制”科技重大专项，治疗乙型肝炎一类新药Y101的临床前研究，2011ZX09102-009-02 4、国家自然科学基金：民族药马蹄金生物活性成分的研究, 1999年批准号：399600815、国家自然科学基金：马蹄金素衍生物的设计、合成及其抗乙肝病毒活性的研究，2007年，批准号：30760292 6、贵州省科技厅重点项目YGT及其衍生物的合成及抗乙肝病毒的研究，黔基合计字(2002)3012号7、贵州省中药现代化项目XGL衍生物的合成及其抗乙肝病毒的研究，黔科合农字200650018、贵阳市科技局重点项目，国家一