细胞培养技术课件

1、细胞培养技术药物科学与技术学院 周立军细胞培养技术药物科学与技术学院参考书目细胞培养，世界图书出版公司，1996年培养细胞学与细胞培养技术 ，上海科学技术出版社，2004年参考书目细胞培养，世界图书出版公司，1996年本次课内容细胞培养的基本知识一、绪论 培养法的种类、培养法的发展、细胞培养的常用术语、培养细胞的作用及意义、培养法的应用二、培养细胞的特征 培养细胞的生长方式和类型、 培养细胞的生长特点和生长增殖过程、 细胞培养的条件及影响因素本次课内容细胞培养的基本知识一、绪论一、绪论一、绪论细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。 即：从活体中取出小块组织分离出

2、细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。涉及有细胞生物学、生物化学与分子生物学、动物学与植物学、病原学、肿瘤学、遗传学、生物工程学甚至光学、物理学等等学科。因其涉及面很广所以已经渗透到生命科学的各个领域。细胞培养（cell culture)细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研组织培养的概念组织培养（tissue culture）： 其本意是指从体内取出组织和细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。组织培养的概念组织培养（tissue culture）：器官培养（Organ culture

3、）： 指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法，以上三个层次的培养，又可统称之为体外培养（in vitro）。器官培养（Organ culture）：培养法的种类体外培养 细胞培养 组织培养 器官培养贴壁培养悬浮培养培养法的种类体外培养 贴壁培养悬浮培养体外培养种类体细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。群体培养（mass culture）：即将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一

4、个细胞形成一个集落，称为克隆。细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。群体培养（左）和克隆培养（右） 群体培养（左）和克隆培养（右） 原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集落形成，细胞围绕中心漩涡状排列100原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集落形成，细原代培养第7天，多个集落形成并融合100 原代培养第7天，多个集落形成并融合100 培养法的发展组织培养法的发展经历近百年。德国人Roux（1885）用温生理盐水体外培养鸡胚组织并存活数月被认为是组织培养的萌芽试验。1903年Jolly用盖片悬滴培养法，培养蝾螈白细胞生活一个月，提示组织或细胞离体后，在人工培养条件下，仍

5、能生存。发展简史培养法的发展组织培养法的发展经历近百年。发展简史培养法的发展关于神经轴突的结构和形成有争议。哈里森（生理学家）首先解剖了蛙胚的原始脊髓节段在淋巴液中进行培养。在显微镜下观察到从神经芽细胞延伸出神经轴突的状况。建立起一套合理的无菌培养技术 哈里森悬滴培养法发展简史培养法的发展关于神经轴突的结构和形成有争议。发展简史哈里森悬滴培养法培养物凝固的淋巴凹玻片槽盖玻片将蛙胚原始脊髓节段，移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴的盖玻片上，淋巴很快凝固，使组织小块固定在一定的位置上。然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上，盖玻片的周缘用蜡封固。蛙胚神经组织存活了数周体外培养组织和细胞的

6、基本模式系统。发展简史哈里森悬滴培养法培养物凝固的淋巴凹玻片槽盖玻片将蛙胚原始脊髓卡氏瓶的发明Carrel用反复传代的方法使细胞系存活34年。他采用的无菌技术，以及后来设计的培养瓶（卡氏瓶，Carrel flask）等都是对组织培养的重要贡献。特别是他的连续培养，为后来的传代培养奠定了基础。发展简史卡氏瓶的发明Carrel用反复传代的方法使细胞系存活34年。组织培养发展示意图 1923年，Carrel设计了卡式瓶培养法，扩大了组织的生存空间。1924年Maximow的双盖片培养法，使之更易于传代和减少污染。发展简史组织培养发展示意图 1923年，Carrel设计了卡式瓶培养1957年Dulbe

7、cco 等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了的单层细胞培养，单层培养成了组织培养普遍应用的技术。促进了细胞系(cell line)的建立。近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术，各国建立细胞库 发展简史1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体我国组织培养的发展20世纪30年代传入我国。20世纪50年代起步。20世纪70年代，成为医学和生物学研究中应用的手段。我国组织培养的发展20世纪30年代传入我国。组织培养常用术语 原代培养（primary culture）：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。 传代培养（passage culture）：将细胞

8、以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。 注：传代（passage，subculture）组织培养常用术语 原代培养（primary cultur原代培养胎儿细胞培养比成人容易；成体组织中成纤维细胞、肾上皮细胞比较容易，上皮细胞培养难。细胞间的分离酶：胰蛋白酶、胶原酶、单一种类细胞的分离培养：根据培养条件培养基、细胞接着面的条件、接着速度、离心法等。术语原代培养胎儿细胞培养比成人容易；成体组织中成纤维细胞、肾上皮细胞系（cell line）：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培

9、养物或细胞系中获得的特殊性质或标志，并能稳定保持这些特性的培养物。克隆（clone）：指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。术语细胞系（cell line）：原代培养经首次传代成功后即成细有分化特性的细胞系和细胞株组织来源细胞系增殖性物种分化特性脾Friend永生小鼠合成血红蛋白Morris肝癌HTC永生 大鼠酪氨酸转移酶诱导髓性白血病K562永生人合成血红蛋白垂体瘤GH2,GH3永生大鼠产生生长激素黑色素瘤B16永生小鼠产生色素髓性白血病HL60永生人合成球蛋白胶质瘤CCM永生人胶质纤维酸性蛋白成神经细胞瘤C1300永生大鼠生长轴突有分化特性的细胞系和细胞株组织来源细胞系增殖

10、性物种分化特性脾对细胞培养技术的评价优点：1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动；2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） ； 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素）； 利用方法：研究技术、记录方法；3、应用广： 领域多：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广：各种动物（低等动物-高等动物-人类） 一种动物（不同年龄、不同组织） 正常或异常（肿瘤）4、较经济： 可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象；对细胞培养技术的评价优点：缺点： 1、培养细胞会发生改变； 2、对人员、设备等要求较高。与体内主要不同 相对孤立、相对单一、缺乏

11、体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋向单一化。 提示 要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。对细胞培养技术的评价缺点：对细胞培养技术的评价细胞培养技术的研究、观察内容细胞内活动：例如能量的代谢、DNA转录、凋亡及蛋白合成等。细胞内部与细胞外界之间的作用：如细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌等。细胞间的相互作用：如形态发生、细胞间的粘着作用、接触抑制、密度抑制等。细胞内的流动：如信号传导、钙离子的流动、RNA的移动、激素受体复合物的易位等。遗传学：如遗传分析、转染、转化等。细胞培养技术

12、的研究、观察内容细胞内活动：例如能量的代谢、DN细胞培养的应用领域 （一）、在病毒学研究中的应用 （二）、在免疫学研究中的应用 （三）、在分子生物学研究中的应用 （四）、在遗传学研究中的应用 （五）、在药理学研究中的应用 （六）、在毒理学研究中的应用 （七）、在肿瘤学研究中的应用 （八）、在器官移植中的应用细胞培养的应用领域 （一）、在病毒学研究中的应用病毒检验方法病毒学病毒培养全程5-30天细胞病变判定荧光染色：1. 病毒涂片2. 血清型专一 抗体荧光染色中和试验：培养出的病毒与血清型专一性抗血清作用，再接种至细胞病毒培养：1.细胞培养2.接种至细胞病毒检验方法病毒学病毒培养全程5-30天细

13、胞病变判定荧光染色检测病毒 C P E正常细胞病变细胞检测病毒 C P E正常细胞病变细胞杂交瘤技术Hybridomas免疫学脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Khler和Milstein, 19751984年Nobel医学奖杂交瘤技术Hybridomas免疫学脾细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫 细胞融合混合细胞的HAT筛选) 分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡 无限生长细胞 分泌X抗体

14、只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c单克隆抗体制备免疫学培养上清中X抗体的检测单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测在分子生物学研究中的应用1、 体外培养细胞的转化2、 DNA转导技术3、基因诊断和基因治疗在分子生物学研究中的应用1、 体外培养细胞的转化器官移植组织工程种子细胞（干细胞）支架材料器官移植组织工程种子细胞（干细胞）组织工程组织工程细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术二、培养细胞的基本特征 培养细胞的生长方式和类型 培养细胞的生长特点和生长增殖过程 细胞培养的条件及影响因素二、培养细胞的基本特征 培养细胞的

15、生长方式和类型（一）培养细胞的生长方式和类型粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。 如：成纤维细胞、心肌与平滑肌细胞、表皮细胞、骨与软骨细胞、肿瘤细胞悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞。 如：血、脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞 （一）培养细胞的生长方式和类型粘附型细胞：附着在某一固相支持粘附型（贴壁型）细胞 粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式 细胞在体内、外的粘附方式存在差异 体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征。 体外：细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时 明显不同。粘附型（贴壁型）细胞 粘附:是大多数有机体细

16、胞在体内生存和粘附型细胞 体外培养下，形态异常可反映其胚层起源，按照培养细胞的形态，可分为几大类型： 成纤维型细胞 上皮型细胞 游走型细胞 多形型细胞粘附型细胞 体外培养下，形态异常可反映其胚层起源，按照成纤维型细胞上皮型细胞成纤维型细胞上皮型细胞游走型细胞多形型细胞游走型细胞多形型细胞成纤维型细胞来源：中胚层间充质组织起源的细胞，如：成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。 形态：类似体内成纤维细胞的形态，胞体呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中央有卵圆形核。生长特点：排列成放射状，漩涡状生长。成纤维型细胞来源：中胚层间充质组织起源的细胞，如：成纤维细胞上皮型

17、细胞来源：起源于内、外胚层的细胞，如：皮肤及其衍生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性肿瘤等。形态：类似体内的上皮细胞，呈扁平、不规则、多角形，中有圆形核。生长特点：细胞紧密相连成单层膜 相靠紧密相连成薄层铺石状 上皮型细胞来源：起源于内、外胚层的细胞，如：皮肤及其衍生物、 培养细胞的形态不稳定，可因各种因素而发生改变，如pH、细胞密度、污染等因素。 HeLa细胞： 血清 高血清成纤维样细胞 低血清上皮样细胞 pH 标准pH上皮样细胞 太酸或太碱成纤维样细胞 细胞密度 低密度成纤维样细胞 高密度上皮样细胞 转化与否 未转化成纤维样细胞 转化后上皮样细胞粘附型细胞 培养细胞的形态不稳定，可因各种因素而

18、发生改细胞培养技术细胞培养技术悬浮型细胞 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长。 来源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞为主。 特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形，呈单个或小细胞团。 悬浮型细胞 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以 优点： 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点： 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)悬浮型细胞 优点： 生存空间大，提供数量大悬浮型细胞细胞培养技术培养细胞的生长特点 粘附并伸展 是大多数体外培养细胞的基本生长特点。细胞在接种后很快便可见到细胞伸出伪足附着，与支

19、持物形成一些接触点，接着细胞逐渐呈扁平或放射状伸展，逐渐形成上皮型或成纤维型或其他类型生长。 密度依赖性 细胞接种密度过高或过低都会影响细胞的生长、增殖。当细胞粘附生长、融合成单层时，细胞变得较为拥挤，而扁平形状的程度减少，与培养基的接触面减少，同时，培养基中的营养物逐渐消耗，细胞分裂减弱，增殖减慢。培养细胞的生长特点 粘附并伸展二、培养细胞的生长增殖过程单个细胞的细胞周期（cell cycle）细胞系的生长过程培养细胞传代的生存期二、培养细胞的生长增殖过程单个细胞的细胞周期（cell cy单个细胞的细胞周期（cell cycle）生长增殖过程MG1SG2间期DNA合成期前中后末有丝分裂期单个

20、细胞的细胞周期（cell cycle）生长增殖过程MG组织培养细胞生命期原代培养期传 代 期衰 退 期组织培养细胞生命期原代培养期原代培养期 又称初代培养期 （primary culture），从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周。 此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形态相似。 细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。原代培养期 又称初代培养期 （primary cult传代培养期初代培养期一经传代后便改称做细胞系cell line。此期为三期中最长，可维持二倍体核型（二倍体细胞系）。当传代3050代后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。

21、衰退期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。传代培养期体外培养细胞一代增殖生长过程体外培养细胞一代增殖生长过程第3代BMSCs的分裂指数曲线第3代BMSCs的分裂指数曲线 接触抑制（contact inhibition）：贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相互接触后便停止了分裂增殖，不再进入S期，也不会出现交叉重叠生长。 恶性细胞无接触抑制现象，所以可将其作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。 密度抑制（density inhibition）：培养液营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细胞分裂停止。培养细胞生长过程中的特点 接

22、触抑制（contact inhibition）：贴壁 传代细胞可连续传710代，细胞形状基本相同，但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现为:细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去贴壁能力，从培养瓶底脱落。 传代细胞可连续传710代，细胞形状基本相同，但随三、细胞培养的条件 水高度纯化 糖葡萄糖 氨基酸12种 维生素 无机离子和微量元素 促生长因子三、细胞培养的条件 水高度纯化各种培养基培养基天然培养基半合成培养基合成培养基血清添加蛋白半合成培养基添加蛋白合成培养基无蛋白合成培养基无血清培养基各种培养基培养基天然培养基半合成培养基合成培养基血

23、清添加蛋白细胞培养技术细胞培养技术血 清 血清的种类 血清的主要成分及主要作用 血清的使用与储存 影响血清的各种因素 细胞培养中使用血清的缺点血 清 血清的种类1、血清的种类 胎牛血清：剖腹产的胎牛 牛血清 新生牛血清：出生24h之内的新生牛 小牛血清：出生1030d的小牛 （人血清、马血清、羊血清）2、血清的主要成分及主要作用 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的。1、血清的种类A因子：能促进细胞早期生长，缩短潜伏期，清除细胞内脂肪滴。B因子：是一种脂肪形成剂，易使细胞产生脂肪滴，

24、其本身是可溶性脂类。 B因子在老年血清中含量较多， 过滤可除去该因子。C因子：可使细胞发生退化。D因子：可促使细胞粘连，是一种粘着 因子。去除B、C因子，可促进细胞生长A因子：能促进细胞早期生长，缩短潜伏期，清除细胞内脂肪滴。去细胞培养技术血清的主要作用 提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子（FN、LN） 提供激素及各种生长因子 （FGF、EGF、PDGF) 提供结合蛋白（中和代谢产物及蛋白分解酶等细胞障碍因素） 对培养中的细胞提供某些保护作用注意点： 血清型号、种类不同，所含营养因素有差别，不可忽视； 在需要观察细胞某种特性时，血清使问题变复杂，要除去。 血清的主要作用 提供基本营养物质血清

25、的使用与储存 使用前的处理 56灭活30min 去除补体成分 （趋势：大部分细胞培养不需灭活； 需要灭活的：巨噬细胞、肥大细胞、血小板、淋巴细胞等） 储存条件 灭活后分装成小包装（10mL、20mL、50mL），20 储存；使用前4 融化。 使用浓度 一般为520，最常用的是10。血清的使用与储存 使用前的处理影响血清的各种因素 年龄：较老动物的血清对细胞生长有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清对细胞生长有利 血色素 胆红质 脂肪酸 血清在培养液中的浓度并非越高越好影响血清的各种因素 年龄：较老动物的血清对细胞生长有抑细胞培养中使用血清的缺点 使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态

26、。 如：血清可以促进成纤维细胞的生长，同时会抑制表皮角质细胞的生长。 血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用。 如：多胺氧化酶每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致。取材过程中有可能带入支原体、病毒，对培养细胞产生影响。细胞培养中使用血清的缺点 使用血清有可能改变某种细胞在影响细胞生长的因素 温度 渗透压 气体环境和pH 无毒和有毒 辐射线和超声波 细胞接种密度 容器转动速度和悬浮搅动速度影响细胞生长的因素 温度温 度 一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度3738，温度过高或过低都会影响到细胞的生长。温度对细胞生长的影响温 度 一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温低 温 在低温下，细胞的代

27、谢活力及核分裂降低。 温度不低于0 时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；再把细胞置于2535 时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢。 若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。 若向培养液中加入甘油或二甲基亚砜等，封入冻存管，置于液氮中，细胞可耐受70 以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，生物性状不受影响。低 温 在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。高 温 细胞在40数小时后，再置回37 培养，细胞仍能继续生长；但如果在40 下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱离瓶底。 细胞在3940 培养1h，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升

28、高2 ，持续数小时，即在4142 中培养1h，细胞损伤严重，温度至43 以上时细胞多数被杀死。 高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。高 温 细胞在40数小时后，再置回37 培养气体环境和pH 氧（O2）参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于95空气加5二氧化碳的混合气体环境中。气体环境和pH 氧（O2）二氧化碳（CO2） CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的pH有关。 大多数细胞适于在pH 7.27.4条件

29、下生长，低于pH 6.8或高于pH 7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。 细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。 随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH 降低。为了维持培养基恒定的pH ，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。 羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。二氧化碳（CO2） CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生无污染及无毒直接或间接接触的器皿、材料污染：细菌等微生物、细胞间、有害物质无污染及无毒直接或间接接触的器皿、材料本章小结 培养细胞

30、的生长方式和类型 培养细胞的生长特点和生长增殖过程 细胞培养的条件及影响因素本章小结 培养细胞的生长方式和类型细胞培养室的设置、设备和准备工作细胞培养室的设一、细胞培养的必备设施 无菌实验室 超净工作台 恒温培养箱 其他设备 （电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）一、细胞培养的必备设施 无菌实验室无菌实验室设计原则：防治微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。组成： 更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。 缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与 几个操作间相通。 操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养， 房间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。无菌实验室设计原则：防治微生物污染和有害因素影响，要求工作环细胞培养技术超净工作台 分类侧流式：气流由左侧或右侧通过台面流向对侧直流式：气流从上向下