代谢工程改造嘌呤合成途径以提高核黄素产量

1、代谢工程改造噂吟合成途径以提高核黄素产量核黄素，又名维生素B2,是人和哺乳动物生长必不可少的一种 营养物质，在生物体内参与多种氧化还原反响，尤其在作为黄素酶类 的辅酶参与细胞中传递氢的相关代谢中起到了重要作用1。核黄素 转化为活性形式：黄素腺喋吟二核甘酸和黄素单核甘酸可以参与促进 生物体内碳水化合物的合成、脂肪酸代谢以及呼吸电子链传递2。 由于哺乳动物自身不能合成核黄素，因而其在饲料行业、食品医药行 业中都着有广泛的应用3-4 o鸟昔三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)是核黄素生物合成的直 接前体5,它既可以以糖和氨基酸为底料进行从头合成，也可以利 用嘿吟碱为前体进

2、行补救合成。嘿吟从头合成途径将戊糖磷酸途径生 成的5-磷酸核糖最终转化成GTP和腺嘿吟核甘三磷酸(adenosine triphosphate, ATP) 0以合成GTP为例，其主要可以分为喋吟操纵子 催化 5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate, PRPP)生成肌昔酸(inosincacid, inosinemonphosphate, IMP),以及 IMP催化生成GTP两个阶段。发酵过程中添加GTP可以提高核黄素产 量6-7,证明喋吟前体的有效供应对核黄素的生产至关重要。并且 利用代谢工程策略增强GTP的合成也已有很多报道本文选用的核黄素

3、高产菌株S1在5 L发酵罐中发酵52 h,核黄素产 量可达27 g/Lo在此基础上利用基于CRISPR/Cas9的碱基编辑器失 活喋吟操纵子阻遏蛋白基因以及鸟喋吟核甘酸(guanylate,GMP)还原 酶来分别提高GTP合成中2个阶段的通量。另一方面尝试过表达GMP 到2,5-二氨基-6-(5-磷酸-D-核糖氨基)喀咤-4(3H)酮(DARPP)合成途 径的基因以增强GTP的合成。1.2实验方法喋吟合成途径基因过表达及失活菌株的构建1.2. 1. 1质粒构建以SG质粒为例，以pHP13-spe-PvegI-mcherry质粒为模板，用引物 pHP131、Pveg2扩增含壮观霉素抗性基因以及P

4、vegI启动子的pHP13 质粒骨架，以B. subtilisl68基因组为模板，用引物UP-gmk、DN-gmk 扩增gmk基因片段，将扩增出来的2个片段用Gibson试剂盒两片段 连接，化学转化DH5a后，挑取长出的菌落用CXPHP131. CXPHP132 引物进行验证，正确的转化子大小为1 293 bp,验证且测序正确后 接入无抗的LB培养基中培养1417 h提取质粒。1.2. 1.2喋吟合成途径基因过表达向目的菌株中用电转化11的方法转入相应基因的过表达质粒，以终 质量浓度为150 ug/mL的壮观霉素进行筛选获得正确的转化子后保 藏。1.3碱基编辑器质粒的构建及嘿吟合成途径基因失活

5、碱基编辑器失活guaC和purR的质粒基于实验室中构建的碱基编辑器 质粒pHP13-spe-dcas9o质粒以pHP13为骨架包含复制起始位点Puc ori,复制蛋白Pep pTA1060,壮观霉素抗性基因spe。其余局部包括 乳糖/IPTG诱导的阻遏蛋白基因lacl, PgraC启动子表达dcas9及脱 氨酶(adenosine deaminase, AID),其中 dcas9 缺失终止密码子，PvegI 启动子连接仅缺少N20的向导RNA。在插入N20序列时，首先需要找 到相应基因序列前中段合适的NGG序列，NGG序列上游20 bp为N20 序列，由于在NGG上游1520 bp更容易利用碱

6、基编辑器发生编辑， 所以在NGG上游1520 bp寻找使C变为T而产生终止密码子的突变， 设计N20以构建质粒。以PDC质粒为例，以pHP13-spe-dcas9质粒为 模板，用引物UP-dcas9-guaC DN-dacs9扩增片段1,用引物UP-dac9 DN-dcas9-guaC扩增片段2,将扩增出来的2个片段用Gibson试剂盒 两片段连接，化学转化DH5 a后，挑取长出的菌落用CX13 spe2、CXJF2 引物进行验证，正确的转化子大小为624 bp,验证且测序正确后接 入无抗的LB培养基中培养1417 h后提取质粒。向目的菌株中用电转化的方法转入相应基因的碱基编辑器质粒，以终 质

7、量浓度为150 Ug/mL的壮观霉素进行筛选获得正确的转化子后， 进行传代培养使目的位点发生编辑并且使质粒丧失，影印后对质粒丢 失的菌进行测序，得到相应密码子突变成终止密码子的菌株进行保藏。 核黄素浓度的测定取 500 口 L 发醉液样品于 1. 5 mL EP (eppendorf)管中，用 0. 1 mol/L NaOH溶液稀释适宜倍数，避光碱溶20 min取出，12 000 r/min离心 1 min,取上清液用分光光度计检测444 nm处的吸光度值，以确定核 黄素的浓度12。残糖测定取500 uL发醉液样品于1. 5 mLEP管中，12 000 r/min离心1 min, 取上清液用无

8、菌水稀释适宜倍数后，用进样针取样，用生物传感分析 仪对样品的残糖进行检测。蔗糖测定取200 uL发酵液样品于1. 5 mL EP管中，加入200 uL配制好的2 mol/LH2s04溶液，于60 水浴锅中水解30 min,力口入4 mo 1/L NaOH 溶液200 uL进行中和，12 000 r/min离心1 min,取上清液用无菌 水稀释适宜倍数，用生物传感分析仪对样品水解后的葡萄糖进行检测 蔗糖的浓度为测得的葡萄糖浓度的2倍。摇瓶补料发酵验证从-80。（2冻存管中取3 hL菌液于含有1 mL无菌水的EP管中，10 倍稀释后混匀，取3 uL涂布SX平板，37 C倒置培养48 h,挑取 直径

9、56 mm的1个单菌落接种2支固体试管SX含相应抗性的斜面 培养基，37 0c静置培养48 h。用1 mL YP培养基清洗下一支斜面上 的所有菌苔于2 mL EP管中，混匀，取300 L菌液分别接种于含有 80 niLYP培养基的500 mL瓶底有挡板的三角瓶中，37 C, 180 r/min 振荡培养41 ho培养过程中分别在11和23 h加入补料培养基进行 补料发酵。2结果与分析2. 1嘿吟合成途径基因失活及补料发酵验证根据文献报道，purR基因编码喋吟合成途径的阻遏蛋白PurR,敲除 purR基因可使嘿吟合成途径基因转录水平大幅提升13-14： guaC基 因为喋吟合成途径GMP还原酶编

10、码基因，敲除guaC基因15可阻断 GMP到IMP的合成，从而使GMP得到一定的积累，间接提高核黄素的 产量。因此对这2个基因用CRISPER/Cas9介导的基因组碱基编辑器 技术进行失活16-17,分别得到菌株SDR和SDC,并对这2个菌株 进行补料发酵验证。由图1-b可知，喋吟合成途径的阻遏蛋白purR碱基编辑器失活后核 黄素产量从2.81降至2. 68 g/L,证明高产菌S1中喋吟合成途径由 PRPP到IMP局部基因转录水平满足核黄素的合成，不是该途径中的 限速步骤；而喋吟合成途径的回补途径基因guaC碱基编辑器失活后, 阻断了 GMP到IMP的合成，核黄素产量由2.81 g/L提升至3

11、. 04 g/L, 产量提升8%。41 h时S1菌以及SDR菌葡萄糖有少量剩余，SDC菌葡 萄糖剩余2. 67 g/L（图1-c）, 17 h时摇瓶内蔗糖已耗尽。SDC菌株核 黄素转化率由S1菌株1 g糖（0. 392 g蔗糖、0. 608 g葡萄糖）产0. 027 5 g核黄素提高至1 g糖（0.399 g蔗糖、0.601 g葡萄糖）产0.030 3 g核黄素，转化率提升10. 2%。a-最大0D600测定值；b-发酵结束核黄素终产量；c-补糖前葡萄糖测 定图1失活基因摇瓶补料发酵Feeding fermentation of inactivated gene in shake flask

12、2.2喋吟合成途径基因过表达以上实验说明guaC基因失活使产量有所增加，推测GMP的供给并没 有到达饱和。基于此推论，尝试将gmk和ndk基因进行过表达（gmk 编码鸟昔酸激酶，催化GMP生成GDP, ndk编码核昔二磷酸激酶，催 化GDP生成GTP),期望通过增加GMP的消耗拉动IMP向GMP的转化 过程。因此对这2个基因以pHP13为质粒骨架，PvegI为启动子构建 质粒PG和PN,电转化进S1菌株，分别得到菌株SG和SN,并且用携 带不含启动子及目的基因的空载质粒S1-空菌株作为对照，进行补料 发酵验证。由图2-a可知，过表达gmk及ndk后对菌株生长无明显影响。图2-b 为核黄素终产量

13、，与对照菌株S1-空相比，SG菌株及SN菌株产量无 明显提高，41 h时葡萄糖无剩余(图2-c), 17 h时摇瓶内蔗糖已耗 尽。这说明单独表达这2个基因并没有拉动GMP的合成，而GTP进入 核黄素合成途径可能是更关键的反响。a-最大0D600测定值;b-发酵结束核黄素终产量；c-补糖前葡萄糖测 定图2gmk、ndk基因过表达摇瓶补料发酵Feeding fermentation of overexpression ofgmkandndkgenes in shake flask2.3ribA基因异源引入及过表达根据文献报道以及 BRENDA 数据库 ( s：/, brenda-enzymes.

14、info/index, php)查询得到枯草自身 RibA双功能酶(EC 3. 5. 4. 25及EC 4. 1.99. 12),但该酶无法将2个 酶的功能拆分，为了将GTP环水解酶n单独过表达，查找到希瓦氏 菌来源的ribA(EC 4. 1.99. 12)。以pHP13为质粒骨架，以PvegI及 Pr为启动子分别对希瓦氏菌ribA基因进行过表达，构建质粒PSA和 PRA,电转化进S1菌株，分别得到菌株SSA和SRA,用含空载质粒的 S1-空菌株作为对照，进行补料发酵验证。图3-a可知，S1-空菌株最大0D600为32. 2,SSA及SRA菌株最大0D600 有不同程度的下降，分别为30.2和

15、23.3。说明希瓦氏菌ribA的表 达对菌的生长产生一定的影响，可能与GTP在GTP环水解酶II催化 下产生的DARPP具有一定的细胞毒性有关。而Pr启动子表达强度强 于PvegI启动子，对菌的生长抑制也表现的较为明显，导致核黄素产 量下降。图3-b为发酵结束时核黄素终产量，SSA菌产量提升至3. 33 g/L,并且发酵结束摇瓶中仍有4.6 g/L的葡萄糖剩余。而SRA菌产 量那么明显下降至2. 69 g/L,耗糖进一步减少，发醉结束摇瓶中葡萄 糖剩余18.4 g/L（图3-c）, 17 h时摇瓶内蔗糖已耗尽。SSA菌株核黄 素转化率为1 g糖（0.407 g蔗糖、0. 593 g葡萄糖）产0

16、.033 8 g核 黄素，转化率较S1提升22. 9双a-最大0D600测定值;b-发酵结束核黄素终产量；c-补糖前葡萄糖测 定图3异源引入基因摇瓶补料发酵Fig. 3 Feeding fermentation of heterologous introduction of genes in shake flask2. 4guaC基因失活及ribA基因过表达组合验证由以上实验可知，失活guaC基因可以提高GMP的供给，PvegI启动 子过表达希瓦氏菌来源的ribA基因可以加快GTP的利用，从而拉动 喋吟途径产物的合成使核黄素产量增加，并且认为这2种效果是可以 叠加的。于是在失活guaC基因的S

17、DC菌中分别转入PSA质粒以及PRA 质粒，得到菌株SDCA和SDCR,并将pHP13-spe空载质粒转入SDC菌 中得到菌株SDCS,用SDCS菌株作为对照，进行补料发酵验证。图4-a说明，摇瓶补料发酵时Pr启动子表达希瓦氏菌来源ribA在 SDC菌中仍会抑制生长。SDCA菌株产量进一步提升，到达3. 43 g/L, 相较于SDCS菌产量提高9. 2%,相较于初始菌株S1产量提升21. 7%（图 4-b）；并且SDCA菌耗糖也有所减少，发酵结束时摇瓶中剩余葡萄糖 3.87 g/Lo SDCS菌发酵结束时没有葡萄糖剩余（图4-c）, SDCA菌株 转化率为1 g糖（0.404 g蔗糖、0. 5

18、96 g葡萄糖）产0.034 6 g核黄 素，较S1菌株提升25.8%,具有一定的工业生产应用价值。a-最大0D600测定值;b-发酵结束核黄素终产量；c-补糖前葡萄糖测 定图4组合基因摇瓶补料发酵Fig. 4 Feeding fermentation of combined gene in shake flask 3结论与讨论SI是1株经过诱变及筛选所得的枯草芽泡杆菌核黄素高产菌株，但 核黄素合成必须的鸟喋吟合成途径并未发生突变。为了使S1菌株核 黄素合成能力进一步提升，主要对喋吟合成途径的相关基因进行失活 以及质粒过表达，结果如下：（1）喋吟合成途径支路基因失活：运用CRISPER/dCas9介导的基因组 碱基编辑器技术失活guaC基因（编码GMP还原酶），阻断了 GMP到IMP 的合成，核黄素产量由2.81提升至3.04 g/L,提升8.2%,转化率提 升 10. 2%o喋吟合成途径下游基因过表达：通过质粒将GMP下游合成基因 gmk (鸟昔酸激酶)和ndk (核甘二磷酸激酶)进行过表达，核黄素产量 没有明显提升，由此确定了这两步反响不是核黄素合成的瓶颈。希瓦氏菌ribA基因引入及过表达：枯草芽袍杆菌中ribA基因编 码的蛋白为一种双功能酶，希瓦氏菌中ribA(EC 3. 5. 4