肠道微生物的分离与鉴定方法

1、一、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽抱杆菌（枯草、地衣）。5 种有害菌：大肠杆菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。4 种二、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产气荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。5 种需氧菌：芽抱杆菌。1 种兼性厌氧菌：大肠杆菌，沙门氏菌。2 种注：空肠弯曲杆菌：微需氧菌,在含 2.5-5%氧和 10%C02 的环境中生长最好。最适温度为3742C。在正常大气或无氧环境中均不能生长。95%例较少。性球菌、乳杆菌及梭菌。四、无氧环境的简易操作：1、方法来自文献健康羊驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定采用干燥器培养空间用焦性没食子酸 Wg、10%氢氧化钠溶100m

2、L,10%的氢氧化钠液置于干燥器皿底部，然后放置2 3 个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸包好，放在圆柱上。既而放上隔板，将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放37c 培养24 48h 观察结果。2、方法来自文献健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析后者先拧紧瓶盖，放入密封性较好的玻璃罐（用凡士林封口），经过蜡烛燃烧 法治作简易厌氧装置。五、CO 2 培养箱不可代替无氧培养箱90%氮气+5%氢气+5%5%二氧化碳+95%02 WOOPpm（千分之一），300Ppm （万分之三），C02 培养箱C02280-2000ppm,CO2（1ppm 即百万分之一）。目前培养厌氧微生物的简

3、便而又有效的技术囊括有：厌氧箱培养术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；1 . 一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于 4 度冰箱保存，且 不能超过 24小时。2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（1ml） 或组织（小于 1cni3）应在 1530 分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中1224 24 小时。低温关于一些厌氧菌有害。采样和运输：同时间、同地点、同位置诀别取两管平行粪样，可适量多取，一输，厌氧菌放置于厌氧生物袋常温运输（24h4c冰箱保存，厌氧菌放置于常温保存。或硫化钠做还原剂，消除培养皿内部氧气。1 . 一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于 4 度冰

4、箱保存，且不能超过 24小时。2 .临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（1ml） （小1cni3）153024 小时。低温关于一些厌氧菌有害。研研培究养微生位样培养皿物种文献名称置品培养基种类条件培养时间度类检测菌株囊括: 双歧杆菌, 拟杆菌 ， 优杆化胃肠道菌胃性球群和胃肠肠需菌，黏膜屏障道粪选择性培养基，具体氧，乳杆的检测菌便不详厌氧 24-72h菌及球母 O10 种双歧杆菌, 乳酸贵州小型菌，猪胃肠道拟杆正常菌群肠10种菌的选择性培养需需氧菌，的初步检道粪基和需氧、厌氧的非氧，菌:24-48h 庆消化菌便选择性培养基厌氧氧菌：48-72h 37cC球荣球菌梭菌肠杆菌肠球菌葡萄球

5、菌。酵 母； 菌10油肉汤浸液琼脂，EC3411J-I粪24-48h3酉C7培u孝母养禎J验用J菌，杆 5种杆 杆健康猪肠道菌群的菌,分离培养肠麦康凯琼脂，MRS增需双歧与耐药性 道 粪 菌液，HYA 琼脂，TYP 氧，需氧菌:24h,菌。3分析菌便琼脂厌氧厌氧菌：48h 37C种健康与腹健康与腹SS琼脂培养大肠泻幼犬肠基，甘油肉汤浸液琼杆道菌群数肠脂培养基，MRS乳酸需菌，量差异分道粪菌、ECEMB氧，沙门析研究菌便肠杆菌，TPY 双歧杆厌氧24-48h37C 氏用培养基MRS 培养基，营养琼健康鸽与脂平板，双歧杆菌腹泻鸽肠肠取养基，麦康凯培养基，需道菌群比道肠 EC 培养基，生化试验 氧，

6、水貂粪便粪营养琼脂培养基，莫厌氧48-72h菌 ， 肠球菌 ， 乳酸杆菌， 双歧杆菌。5种 芽抱 杆菌 ， 乳 酸 杆菌， 双 歧 杆菌，大肠肠球菌。537 c 乳酸较研究菌道培养基厌氧24-72h37c种乳酸杆菌乳酸杆菌MRS的分离与培养基，营养肉汤培菌，鉴定养基，生化试验培养嗜酸基性乳酸杆菌， 干酪乳酸杆菌。3种杆 水貂粪便粪营养琼脂培养基，莫厌氧 48-72h37 c 乳酸猪源益生猪源益生地衣芽抱杆菌芽孑包的分离鉴LB 培养基，淀粉培养杆定与生物基，酪素培养基，竣需菌，学特性分粪甲基纤维素钠培养氧,枯草便基。厌氧18-24 h37C芽抱杆菌。3种厌氧菌的培养方法厌氧菌在有氧的情况下不能生

7、长。要培养厌氧菌，必需创造一个无氧的环 境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以 降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。 常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧坏境，从而将 厌氧菌培养出来。气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钳催化剂管、干燥剂。放入已接种好 的平板后，尽快挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美 兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧 状态，可以孵育。便基。厌氧18-24 h37C芽抱.厌氧手套箱：是迄今为止国际上

8、公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有 两个手套，可经过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二 门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进 行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入 箱内，关上内门。箱内保 持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钳的催化下和箱 中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其 内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的 大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌 氧箱的抽

9、气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。碳，供细菌生长用。我没见过。NaHC03NaOH面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反映后 耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽抱杆菌。7试管，液面封凡士林，造成无氧环境。厌氧菌标本的采集与送检厌氧菌标本采集与送检必需注意两点：标本绝关于不能被正常菌群 所污染； 应尽快避免接触空气。.采集：采集标本须注意：不被正常菌群污染，并且尽快避免接触空气。采集深部组织 标本时，需用碘酒消毒皮肤用注射器抽取，穿刺针头应准 确插入病变部位深部, 抽取数毫升即可，抽出后可排出一滴标本于酒精棉球上

10、。若病灶处标本量较少, 则可先用注射器吸取 1ml 还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。在紧急情 况下，可用棉拭取材，并且用适合的培养基转送。厌氧培养最理想的检查材料是 组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长医。筒抽取等，应严格无菌操作，严禁接触空气。不同部位标本采集方法也各有不同特点.送检方法与处理标本送到实验室后，应在 20-30m i n 内处理完毕，最迟不超过 2h,以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而克制厌氧菌的生长。如不能即时接种， 可将标本置室温保存（一般认为，冷藏关于某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶 解度较高）。针筒运送：一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无

11、菌橡皮塞，以隔绝空气，立即送检。这种方法多用于液体标本的运 送，如血液、脓液、 胸腹水、关节液等医.C02时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将 用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。无氧环境。该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。厌氧菌的分离鉴定及注意事项60 菌混合感染，故开展厌氧菌的试验关于感染的诊断、治疗都有重要意义。- 、厌氧菌样本的采集 Co I I ect i on of anaerob i c bacter i a s spec imens标本避免正常菌群污染和氧接触，采用下列方法：（1

12、）脓胸及未破溃的脓肿：皮肤消毒后,以无菌注射器抽取（排尽空针及针头内的气体)，将针头插入无菌橡皮塞内送检。肺分泌物和痰标本:用支气刷采取或环甲膜穿刺术。尿液标本：用无菌注射器从耻骨上缘行膀脱穿刺术抽取。脉，待血液流出后将另一端针头立即插入培养瓶内(瓶内负压)，使血液直接 流入培养瓶内。窦道、深部脓肿等的标本：可用特别采样器采取。、涂片与染色 Smear preparation an stain+”表示。镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也能为鉴定药物。三、标本接种 I nocu I at i ng3 5 % 10 % C02 的环境中培养。如果只要求检出厌氧菌，只需接种个厌氧血琼脂平板，

13、也可增加 1 个相应的选择厌氧血琼脂平板。为便于在混合培 养3 1 2 1 硝哗(5 mg/片)纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有厌氧菌生长。不同厌氧菌的生长速度和菌落形态各异，色素也有不同，荧光生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类：.革兰阴性杆菌BBE琼脂平板上有灰黑色、直径1mm晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。色荧光者，为产黑素普雷沃菌。拟杆菌。菌。是小韦荣球菌。.革兰阳性球菌排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。4.苹兰阳性无芽胞杆菌菌落呈臼齿形、粗糙，结核脓样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。X、YV排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。5 Nagi er有荚膜，

14、可鉴定为产气荚膜梭菌。四、耐氧试验 Oxygen to I era nee test45 2 块需氧血 琼脂平板1 46 区，每区种一个可疑菌 落)，然后将平板诀别放置在需氧、二氧化碳和厌氧坏境中培养。凡在厌氧环境生长而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性厌氧菌需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌；在需氧和二氧化碳环境中生长，而在氧环境中不生长者为专性需氧菌；在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好的细菌为 需二氧化碳菌。五、 鉴定试验 I ent i f i cat i on test可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及关于某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反映及终末代谢产物等检查。生化试验主要囊括多种糖类发酵试验、呻噪试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶试验、明胶液化试验及胆汁肉汤 生长试验 和硫化氢试验等。目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验，h VITEK-ANI、MicroS can- AN I 等