实验一分光光度技术及蛋白含量测定

1、关于实验一分光光度技术及蛋白含量测定第1页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三理论 掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造实验 利用分光光度计进行蛋白质定量测定 1.双缩脲法测定蛋白质含量 2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 3.紫外分光光度法测定蛋白质含量 本次实验内容第2页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三分光光度技术（Spectrophotography）第3页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三 一、基本定义 利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术 。 应用：定性、定量 优点：灵敏度高 精确度高 操作

2、简便、快速 第4页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三二、工作原理 1.物质对光线有选择性吸收作用。 2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质 的浓度成正比。 分光光度法所使用的光谱范围： 200nm - 10m200-400nm 400-760nm 760-10 000nm紫外光区 可见光区 红外光区第5页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三 如何定性？ 利用吸收光谱鉴定化合物利用分光光度计绘制吸收光谱曲线 用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制

3、吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。每种物质有其特征性的吸收光谱 第6页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三 1. 朗伯（Lambert）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。 I/I0=e-K1l I0 :入射光强度； I :透射光强度；l ：介质厚度 如何定量？ Lambert - Beer定律第7页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三2比尔（Beer）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。 I/I0=e-K2C I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 第8页

4、，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三3.Lambert-beers law的合并 一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。 I/I0=e-cl A=-lg I/ I 0=cl A：吸光度； C：溶液浓度； L：液层厚度 ：即摩尔消光系数，也叫摩尔吸光度，溶液浓度为 mol/L,光程为1cm时的消光系数第9页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三4.计算（1）标准管法（标准比较法） 实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。 A标准=标准C标准L标准 A样品=样品C样品

5、L样品 A：吸光度； ：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度第10页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三 因标准液和样品液中溶质为同一物质， 样品= 标准 因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样品=L标准 故上二式可写成： A标准/A样品= 标准C标准/ 样品C样品 C样品=A样品/A标准 C标准第11页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三（2）标准曲线法 配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。 以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。 第

6、12页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三标准曲线使用注意事项标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。吸光度在0.05-1.0范围内。所作标准曲线仅供短期使用。标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，避免误差产生。第13页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三5应用中注意的问题 Lambert-beers law的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.051.0之间，超过该范围偏离计算结果与实际浓度不相符 选择波长：最大吸收波长，因为a.灵敏；b.避免杂质干 扰 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的

7、成分。第14页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三 空白管： 测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。 测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。第15页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三分光光度计第16页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三一基本部件 1光源 分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氢灯 (或氘灯)。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨 灯；在紫外光区，多使用氢灯

8、。 2单色器 棱镜或光栅，把混合光分解为单一波长的光。 3吸收池（比色皿、比色池） 选用合适的比色皿（可见 光玻璃；紫外光 石英；规格、新旧程度一致） 4检测器 5测量装置 第17页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三 二. 分光光度计使用步骤（示教） 三. 使用时注意事项 1. 波长选择。 2. 机器预热。 3. 不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光 电管疲劳。 4. 不应把成有腐蚀性液体的比色皿放在仪器表面。 5. 比色皿使用注意事项第18页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三 1.由于紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区测量时要用石英比色皿。

9、2.同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）。 3.比色皿2光面与2毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。 4.比色皿中所盛溶液不能太少，也不能太多，一般所盛液体约占全部容积的2/3。 5.腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中。 6.每次使用后,应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿34次。本次试验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。第19页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三蛋白质定量分析实验 实验一 双缩脲法测定蛋白质含量 实验三 考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 实验四 紫外分光光度法测定蛋白质含量 第20页，共29页，202

10、2年，5月20日，22点7分，星期三 实验一 双缩脲法测定蛋白质含量【基本原理】 蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。 在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。 含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。 双缩脲法的灵敏度为1-20mg。第21页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三试 剂 （ml） 1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液0.10.30.50.70.9生理盐水0.90.70.50.30.11.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0【操作步骤】（

11、一）标准曲线的绘制1. 取小试管6支，编号按下表操作 2混合后，于37水浴中放置15分钟，在520nm波长下比色，以 第6管调零，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵 座标，蛋白质浓度的克数为横座标，绘成曲线。第22页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三（二）样品测定： 取血清样品0.1ml，加生理盐水0.9m1，再加双缩脲试剂4m1，于37水浴中放置15分钟，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线并计算得出每l00ml血清（样品）中蛋白质的克数。 注意： 双缩脲法的灵敏度为1-20mg， 取蛋白标准液时注意浓度 实验时， 样品管可与标准管同时处理第23页，共29页，2022

12、年，5月20日，22点7分，星期三【基本原理】 考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质可通过范德华力结合，与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成595nm，能过测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 优点：灵敏度高，1-5g；测定速度快；干扰物质少。 现已被广泛使用。实验三 考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量第24页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三1取试管3支，编号按下表操作 试 剂（ml） 空白 标准 标本 生理盐水 0.1 蛋白标准液(50ugml) 0.1 样 品 0.1 考马斯亮蓝试剂 5.0 5

13、.0 5.02.混匀，放置5分钟，在波长595nm处，以空白管调“0”，测定各管的吸光度。【操作步骤】第25页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三3. 计算 A标本/A标准 50 （g/ml） = 样品中蛋白质的含量（g/ml） 注意：蛋白标准液浓度50 g/ml第26页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三实验四 紫外分光光度法测定蛋白质含量【基本原理】 由于蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测定。 灵敏度：50-100g第27页，共29页，2022年，5月20日，22点7分，星期三【操作步骤】（一）制作标准曲线 1.取试管6支，编号，按下表操作。 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理盐水 3