腺病毒介导脑源性神经营养因子基因在培养的雪旺细胞中的表达

1、腺病毒介导脑源性神经营养因子基因在培养的雪旺细胞中的表达【摘要】观察腺病毒介导人脑源性神经营养因子brain-derivedneurtrphifatr,BDNF基因在培养的雪旺细胞Shannell,S中的表达，为视神经损伤修复提供可靠的组织工程用的种子细胞。方法：在293细胞中培养扩增BDNF重组腺病毒adenvirallydeliveredBDNF,Ad-BDNF，采用蚀斑形成试验测定其感染滴度。体外培养SD大鼠源性的S，以Ad-BDNF感染培养的S，用逆转录聚合酶链反响reversetransriptaseplyersehainreatin,RT-PR检测BDNFRNA的表达，用免疫印迹技

2、术iunbltassay,esternBltting和酶联免疫反响检测enzya-linkediusrbentassay,ELISA培养液上清中BDNF的表达。结果：Ad-BDNF经扩增后可获得较高感染滴度的重组腺病毒载体。在正常培养条件下未经Ad-BDNF感染的S低表达BDNF，而感染3d后的S其BDNF表达明显升高，表达量随时间延长而增加，并能在感染21d后仍维持高表达趋势。结论：Ad-BDNF可以介导BDNF基因转染到培养的S中，后者可以在较长时间内高效表达BDNF。【关键词】视神经损伤0引言视神经作为特殊分化的中枢神经，其损伤后部分微环境中的神经营养因子neurtrphifatr,NT

3、F在其修复和再生的过程中发挥了重要作用，脑源性神经营养因子brain-derivedneurtrphifatr,BDNF就是较早被肯定的其中之一1。在体内和离体实验中已证实，BDNF可维持、促进外周神经嵴和外胚层基板来源的多种感觉神经元的发育、生长和分化2，支持视网膜神经节细胞retinalganglialell,RG的体外存活3，在治疗神经系统疾病和视神经损伤中有重要意义。雪旺细胞Shannell,S的BDNF根底分泌量很有限4，采用基因转染技术可使S具有高效分泌BDNF的才能，再将其通过组织工程学的方法移植到视神经损伤部位，既能维持BDNF的有效作用浓度到达促进视神经修复和再生的目的，又能

4、防止BDNF给药途径上的不便。目前，采用腺病毒载体介导实现BDNF基因在体外培养的S中表达的研究尚未见报道。我们采用载有人BDNF基因的重组腺病毒Ad-BDNF感染SD大鼠源性S，从RNA和蛋白分子表达程度检测BDNF基因在S中的表达情况并讨论其进一步意义。1材料和方法1.1材料所用Ad-BDNF系与中国军事医学科学院根底医学研究所合作研制，本实验室保存，293细胞系本实验室保存。山羊抗S-100多克隆抗体、兔抗BDNF多克隆抗体Sataruz公司，Trizl总RNA提取液和RT-PR反响试剂盒Invitrgen公司，BDNF蛋白ELISA检测试剂盒Prega公司，新生SD乳鼠购自第四军医大学

5、实验动物中心。1.2方法1.2.1Ad-BDNF的扩增及滴度测定正常培养的293细胞密度到达90%集合时，参加适量Ad-BDNF液，更换为含50L/L新生牛血清的DE培养液继续培养35d，搜集出现细胞病变效应ytpathieffet,PE的293细胞，在-80和37之间反复冻融3次，离心弃沉淀，病毒上清再经sl线性密度梯度超速离心纯化后搜集分装于-80保存备用。Ad-BDNF的感染滴度采用蚀斑形成试验测定。1.2.2SD大鼠源性S的培养将7日龄SD乳鼠脱颈处死后，剪取双侧坐骨神经用含青霉素、链霉素均为500kU/L的PBS溶液浸洗、去除血污。神经组织参加2.5g/L胰蛋白酶、2g/L型胶原酶混

6、合消化60in后终止，100目筛网过滤，搜集滤液，1000r/in离心5in，沉淀参加含100L/L胎牛血清的DE培养液重新悬浮，采用双30in差速黏附法接种细胞，置于37，50L/L2条件下培养。接种24h后向培养液中参加10-5l/L/阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长，24h后吸弃，更新培养液继续培养，以后3d更换1次培养液，至细胞交融后以2.5g/L胰蛋白酶消化传代。采用山羊抗S-100多克隆抗体免疫细胞化学进展鉴定。选用第34代的细胞用于实验。1.2.3Ad-BDNF感染S取密度为5108/L的S悬液2L接种到6孔板孔内，当细胞密度大于80%时，吸弃培养液，根据不同I计算所需的病毒量，取相应

7、体积的Ad-BDNF液参加孔内，37，50L/L2条件下感染S，90in后吸弃，更换为正常培养液继续培养。1.2.4RT-PR检测BDNFRNA的表达以I分别为0即未感染对照组,50,100,200,400的病毒量感染S，感染后24h将各组S搜集于塑料离心管中，10000r/in离心10in，参加Trizl液0.1L使细胞充分裂解后参加氯仿0.02L抽提，12000r/in离心15in，汲取上清参加异丙醇0.05L，室温放置10in后12000r/in离心10in，沉淀参加750L/L乙醇清洗混匀后，7500r/in离心5in，沉淀37烘干后溶于DEP水20L中，用A260/A280比值鉴定R

8、NA纯度。在Invitrgen公司的TherSriptTRT逆转录酶作用下，以lig(dT)20为引物，50反响1h，85反响30in，将RNA逆转录合成DNA。取逆转录反响液2L进展PR扩增，BDNFDNA特异性引物序列参照文献设计5，上游引物为5-ATTGATGGGAG-3，下游引物为5-GATTTAGGTGAATATAG-3，产物长度为430bp。反响条件：94变性1in，60退火1in，72延伸1in，30个循环。取10L扩增产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳检测，条带的光密度由凝胶成像仪分析。1.2.5esternBltting检测培养液上清中BDNF蛋白的表达以I分别为0，50，100

9、，200，400的病毒量感染S，感染后24h搜集培养液上清。上清经低速离心去除分子质量小于3000u的蛋白，150g/LSDS电泳后，蛋白经100V恒压，1h电转移至硝酸纤维素膜上，TBST洗膜后用30g/LBSA/PBS室温封闭2h，兔抗BDNF多克隆抗体11004孵育过夜，TBST洗膜后用HRP标记的羊抗兔IgG1100室温孵育3h，TBST洗膜后EL化学发光法显影，条带的光密度由凝胶成像仪分析。1.2.6ELISA检测BDNF蛋白表达的时效性感染组以I为200的病毒量感染的S，对照组为正常培养的同一代S，分别在感染后3，6，9，12，15，18，21d搜集培养液上清。搜集到的上清保存于-

10、80。检测步骤按照Prega公司的BDNF蛋白ELISA检测试剂盒说明书进展。全部数据采用SPSS12.0统计软件进展方差分析。2结果2.1Ad-BDNF的滴度测定Ad-BDNF的感染滴度经蚀斑形成试验测定，病毒原液扩增、纯化后的感染滴度为8.161012pfu/L。2.2培养S形态鉴定在倒置相差显微镜下可见，SD大鼠源性原代S接种24h后多数细胞已贴壁、伸展；72h后生长良好，形成较多单克隆集落。原代S经810d传代1次。S的典型形态为长梭状，胞体细长，胞核不明显，胞膜折光性强；细胞间呈复层生长，胞体互相重叠，单克隆集落常呈索带状。S-100染色阳性细胞为S，其胞体内出现棕黄色着色以胞质为主

11、,强阳性时胞核也会出现着色，细胞边界清楚，与镜下所见形态一致。2.3感染后S中BDNFRNA的表达提取感染各组和对照组S的总RNA，用RT-PR均扩增出了约430bp的基因片段，与构建的表达单元大小一致，其中DNA条带灰度以I为200组为著，对照组最低。此结果证实，经Ad-BDNF感染的S有BDNFRNA的转录表达，且表达量明显高于未感染的S；I为200感染时，人源性BDNF基因转染效率最高图1。0:未感染对照组，1:I50，2:I100，3:I200，4:I400，:DNAarker图1不同I感染S后BDNFRNA的表达2.4感染后S无血清培养液上清中BDNF的表达由于构建的BDNF基因带有

12、BHGpA信号肽序列，因此S表达的蛋白可以分泌至培养液上清中。经esternBltting检测，Ad-BDNF感染各组和对照组的S培养液上清均有13ku的BDNF蛋白条带存在，其中蛋白条带灰度以I为200组为著，对照组最低。此结果证实，经Ad-BDNF感染的S的BDNF表达量明显高于正常培养的S；I为200感染时表达效率最高，这与RT-PR检测的RNA结果比拟吻合图2。0:未感染对照组，1:I50，2:I100，3:I200，4:I400图2不同I感染S后培养液上清中BDNF的表达2.5ELISA检测培养液上清中BDNF的表达感染的S在感染3d后BDNF表达量即开场出现升高，612d升高趋势明

13、显，1521d升高趋势减缓，但BDNF表达量可以维持在较高程度，即15,18,21d时BDNF表达量无显著性差异(多样本均数间SNK-q检验，P0.01)。对照组也表现出随着时间变化，BDNF表达量升高趋势，但在各时间点BDNF表达量均明显低于感染组(配对t检验，P0.01，表1)。3讨论在研究视神经损伤的早期，学者们普遍认为视神经作为特殊分化的中枢神经在损伤后不可修复和再生，这一观点直到1981年才被Aguay等6推翻，他们发现受损的RG轴突在含有S的周围神经桥接物中可以再生。其中S不仅在视神经损伤处形成细胞索支持和引导再生的神经轴突长入和延伸，还能分泌包括BDNF在内的多种NTF营养受损的

14、RG7。之后的研究又证实BDNF对于视神经损伤修复是较为肯定的。Saai等8采用眼球内注射BDNF可以促进轴突切断后RG的存活及轴突的再生。Hisanari等9将负载有细胞外基质extraellularatrix,E、体外培养的S和BDNF的硅胶导管桥接大鼠视神经断端，结果发现其对RG轴突再生的促进作用明显优于负载任一单因素的硅胶导管。侯旭等10,11采用向视神经夹伤后的大鼠玻璃体腔内注射Ad-BDNF的方法发现，其可以转染外源性BDNF基因到RG中并促进RG的存活及轴突的再生。但这些方法在临床应用上仍缺乏可行性和平安性，作用比拟有限。我们借助组织工程学和基因转染技术将培养的S和外源性BDNF

15、基因结合起来，试图将其进一步应用于视神经损伤修复。在转染效率和表达效率的平衡点上我们选择了腺病毒载体，它不仅可以感染包括神经元细胞和胶质细胞在内的多种细胞12，而且具有转染效率高，耐受性好，低病源性等优点。结果证实，Ad-BDNF可以有效感染体外培养的SD大鼠源性S，并介导外源性BDNF基因转染到S中，而转染有BDNF基因的S可以高效表达BDNF蛋白。通过以不同I感染S，我们发现制备后感染滴度为8.161012pfu/L的Ad-BDNF在I为200时转染BDNF基因效率最高。这可能与制备的Ad-BDNF本身性质有关。在讨论感染的S分泌BDNF的时效性时，我们发现随着感染后时间的延长，分泌的BD

16、NF在短期内感染后3d即呈现出明显的升高趋势，说明腺病毒载体转染的高效性。在10d内感染后312d很快到达较高浓度后进入维持阶段，维持10d感染后1221d甚至更长时间。这种长效性为将其应用于视神经损伤修复，防止屡次反复给药提供了先决条件。与未感染对照组比拟，感染组在各个时间点的表达量均明显高于对照组P0.01，分别在感染后12，15，18，21d升高了5.2，5.0，4.7，4.4倍。在维持阶段，感染组的BDNF表达量略有下降，可能与S生长密度过高、发生接触抑制和少数外源性BDNF基因的衰减、丧失等因素有关。总之，通过腺病毒介导外源性BDNF基因的转染，可以获得高效、长效表达BDNF蛋白的S

17、，这将为进一步修复视神经损伤和恢复一定程度的视功能提供前提条件。在含有高浓度BDNF的微环境下，受损的RG可能更容易存活、轴突更容易再生。转染有BDNF基因的S能否通过细胞支架材料复合移植的方法应用于视神经损伤后RG的修复和再生？这些问题还有待下一步实验解决。【参考文献】1Takan,HrieH,IijiaY,Dezaa,SaadaH,IshikaaY.Brain-derivedneurtrphifatrenhanesneuriteregeneratinfrretinalganglinellsinagedhuanretinainvitr.ExpEyeRes,2002;74(2):319-323

18、2AkliS,aillaud,VigneE,Stratfrd-PerriaudetLD,PenaruL,Perriaudet,KahnA,PeshanskiR.TransferfafrEigngeneintthebrainusingadenvirusvetrs.NatGenet,1993;3(3):224-2283ThansS,Balr,BardeYA,VanselJ.Survivalandaxnalelngatinfedultratretinalganglinells.EurJNeursi,1989;1(1):19-264eneiP,nter-enei,hittereSR,BungeRP,B

19、ungeB.ShannellsgenetiallydifiedtseretehuanBDNFprteenhanedaxnalregrtharsstransetedadultratspinalrd.EurJNeursi,1998;10(2):607-6215陈谦,汪家政,刘红,吴燕,范明.人脑源性神经营养因子及神经营养素-3重组腺病毒的构建及表达.生物化学与生物物理学报,2000;32(2):121-1256AguayAJ,DavidS,BrayG.Influenesftheglialenvirnentntheelngatinfaxnsafterinjury:transplantatinstudiesinadultrdents.ExpBil,1981;95(3):231-240