彝药野坝子花总黄酮的提取及对活性氧自由基的清除作用

1、彝药野坝子花总黄酮的提取及对活性氧自由基的去除作用【摘要】目的研究野坝子花中总黄酮的提取及其对活性氧自由基的去除作用。方法采用醇提酸沉法提取野坝子花中总黄酮，对所提取的黄酮类物质进展验证，并用分光光度法测定黄酮含量，用总黄酮对活性氧自由基去除作用进展实验。结果样品中总黄酮含量为=0.2352g/l，对H和-2的去除率分别可达30.85%和44.52%。结论野坝子花中黄酮类物质对H和-2有较好的去除才能。【关键词】野坝子花；总黄酮；羟自由基；超氧阴离子自由基黄酮类化合物(flavnids)是一类重要的广泛存在于自然界的天然有机化合物，是目前备受关注的天然产物之一，在植物体中通常以游离或与糖形成苷

2、的形式存在。黄酮类化合物作为一种功能成分，具有许多有益的生物学活性1,2，其中重要的生物学活性之一是减少自由基形成、消除自由基的抗氧化活性。野坝子Elshltziarugulsa是唇形科香薷属植物，是云南楚雄彝族人民的常用植物药之一，它是一种药食同源的植物，广泛分布于云南各地。野坝子是汉药名，在各地叫法不一，又名野坝蒿、野巴子、野拔子、野香苏、野苏草、夸巴脂、小铁苏、扫把茶、草拔子、草芝麻蒿、皱叶香薷等，其彝药名为阿能抛，始载于?中国彝药学?，全草均可入药，在?全国中药汇编?中记载了其药效。现今，有学者对野坝子进展了红外光谱分析3、化学成分分析4等研究工作，而对其中黄酮类化合物抗氧化性的研究尚

3、未见报道。本文对野坝子花中总黄酮进展提娶鉴定，并研究其总黄酮对羟自由基H及超氧阴离子自由基-2的去除作用。1材料与仪器1.1材料野坝子花采自云南楚雄市西山公园，经楚雄师范学院化学与生命科学系徐成东博士鉴定为唇形科香薷属植物野坝子花。1.2试剂芦丁日本和光纯药工业株式会社；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、盐酸、锌粉均为国产分析纯；水为实验室自制超纯水。1.3仪器754型紫外可见分光光度计上海第三分析仪器厂制造，HH-S2型恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器，P214电子天平奥豪斯仪器制造，SHZ-IIIA型循环水式真空泵巩义市英峪予化仪器厂等。2方法与结果2.1总黄酮

4、成分提取准确称取一定质量的野坝子花干粉，用50%的乙醇预浸18h，于80回流提取3h共2次，提取液浓缩后，加盐酸调节pH值至34，使黄酮类化合物沉淀，沉淀以50%的乙醇溶解并定容于250l容量瓶得样品液。2.2总黄酮成分的鉴别5,6取样品液1l于试管中，分别参加以下试剂，结果见表1。表1黄酮类化合物的定性鉴定略由表1可以说明，野坝子花的提取物是黄酮类化合物。2.3总黄酮含量测定2.3.1测定方法根据以芦丁为对照品测定野坝子花中黄酮类化合物的含量，参加铝离子试剂，在碱性条件下使黄酮类化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。2.3.2测定波长选择准确汲取1.00l的样品液于25l

5、比色管中，加5%亚硝酸钠溶液1.00l；10%硝酸铝溶液1.00l；4%氢氧化钠溶液10.00l，再加50%乙醇至刻度。以试剂空白作参比，在400700n之间测定络合物吸光度,络合物在510n处有最大吸收，故测定时选用此波长。2.3.3标准曲线的绘制准确汲取0.200g/l的芦丁对照品溶液0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00l分别置于25l比色管中，各加5%亚硝酸钠溶液1.00l，混匀，放置6in；加10%硝酸铝溶液1.00l，混匀，放置6in；加4%氢氧化钠溶液10.00l，再加50%乙醇至刻度，摇匀，放置10in。在510n波长处以试剂空白为参比测定吸光度，绘制标准

6、曲线，得回归方程为A=0.01135-0.02648，r=0.9995。所得标准曲线见图1。2.3.4提取液总黄酮含量的测定精细量取样品溶液1.00l，置于25l比色管中，按标准曲线的绘制项中操作方法显色后，测定出试液吸光度，根据回归方程，计算出原样品溶液总黄酮的含量为=0.2352g/l。转贴于论文联盟.ll.2.4总黄酮提取物对羟自由基H去除作用7参照Fentn反响的方法建立反响体系模型。利用H22与Fe2+混合后产生存活时间短，具有很高反响活性的H这一性质，在反响体系中参加水杨酸后，就能有效地捕捉H，并产生有色产物，该产物在510n处有强吸收。假设参加具有去除H功能的黄酮类化合物时，黄酮

7、类化合物便会与水杨酸竞争H,从而使有色产物生成量减少。采用固定反响时间法，在510n处测量含被测物反响液的吸光度，并与空白液比拟，便能测定被测物对H的去除作用。反响体系为:在10l比色管中加9l/LFeS42.00l,9l/L水杨酸-乙醇溶液2.00l，不同浓度的野坝子花总黄酮提取液1.00l，最后加8.8l/LH222.00l启动反响，加蒸馏水定容至刻度，37反响0.5h，以蒸馏水为参比，以试剂空白作比拟，在510n处测定各浓度的吸光度，考虑到提取液本身的吸光度，在10l比色管中加9l/LFeS42.00l,9l/L水杨酸-乙醇溶液2.00l，不同浓度的野坝子花总黄酮提取液1.00l,蒸馏水

8、定容至刻度，37反响0.5h，作为样品液的本底吸收。去除率计算公式为：H去除率(%)=A0-(Ax-Ax)/A100%式中:A为空白对照溶液吸光度;Ax为样品液吸光度;Ax为不加H22样品液的本底吸光度。2.5总黄酮提取物对超氧阴离子自由基-2去除作用采用邻苯三酚自氧化法测定8。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出-2，随着反响的进展-2不断积累，在反响开场后5in之内，反响液在325n波长处的吸光度随反响时间而线性增大。因此于325n处测量含被测物反响液的吸光度随时间的变化率，与空白液比拟即可得出被测物对-2的去除率。在10l比色管中分别参加50lL-1Tris-Hl溶液pH8.24.5

9、，4.2l超纯水，混匀后在25水浴中保温20in，取出后立即参加于25水浴预热的3l/L邻苯三酚0.3l以10lL-1Hl代替邻苯三酚作空白，迅速混匀后在325n下每隔30s测定吸光度，到5in时停顿，计算对照液吸光度随时间的变化率F0。依上法，在参加邻苯三酚前先参加1l野坝子花总黄酮提取液，再依次参加Tris-Hl缓冲液，超纯水，混匀后在25水浴中保温20in，取出后立即参加于25水浴预热的3l/L邻苯三酚0.3l，迅速混匀后在325n下每隔30s测定吸光度，到5in时停顿，计算样品液吸光度随时间的变化率Fx。去除率计算公式：去除率(%)=(F0-Fx)F0100%2.6测定结果野坝子花黄酮

10、提取物对超氧阴离子自由基-2去除率的测定结果见表2。表2黄酮类化合物去除H和-2测定结果略3讨论正常情况下，活性氧自由基在抗菌、消炎和抑制肿瘤等方面具有重要意义。在疾病和某些外源性药物和毒物入侵后，机体抗氧化体系可能发生紊乱，导致自由基代谢平衡失调，进而使生物膜和蛋白质、核酸等大分子发生脂质过氧化损伤。许多天然产物具有去除活性氧自由基的作用，其中黄酮类化合物是活性较强的一类，已成为当今众多学者研究的热点。黄酮类化合物由于其特殊的构造使它能选择性地抑制体内酶的活性而具有抗氧化性；可通过与金属离子发生互相作用而具有抗氧化活性；还可通过酚羟基与自由基反响生成较稳定的半醌式自由基，终止自由基链式反响这

11、也是黄酮类化合物去除自由基的最主要方式而具有抗氧化活性9。本实验研究说明，彝药野坝子花中黄酮类化合物具有较强去除羟自由基H和超氧阴离子自由基-2的作用，对H的去除才能随黄酮浓度的增加而增强，有量效关系；总黄酮浓度在07g/l范围时，对-2去除率随黄酮浓度的增大而增强。【参考文献】1陈国有,齐鹤,徐东花,等.黄酮类化合物的生物活性研究进展J.黑龙江医药,2022，21(3)：81.2华辉,郭勇.黄酮类化合物药理研究进展J.广东药学,1999,9(4):9.3张丽梅,王怡林,董勤,等.彝药野坝子FTIR光谱法分析J.楚雄师范学院学报,2022,20(6):27.4赵勇，李庆春，赵焱,等.野拔子的化学成分研究J.中国中药杂志，2022，29(12)：1144.5陈业高.植物化学成分.北京：化学工业出版社,2022:229.6宋晓凯，吴立军.天然药物化学.北京：化学工业出版社,2022:78.7陈留勇,孟宪军,贾薇,等.黄桃水