自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

1、廉价多聚胺阳离子脂质体转染服从及细胞毒性的评价孙瑞琳，金发光，吴道澄，吴红，刘彬，温德升【关键词】多聚胺阳离子脂质体；制备；转染Evaluatinftransfetineffiienyandyttxiityfselfpreparedplyaineatinilipse【Keyrds】plyaineatinilipse;preparatin;transfet【摘要】目的：评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染服从及细胞毒性.要领：多聚胺阳离子脂质Thl与中性磷脂DPE以31摩尔比，制备多聚胺阳离子脂质体，通过转染以加强型绿色荧光卵白为陈诉基因的质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞,H

2、ep2细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的陈诉基因表达，通过TT法，检测细胞存活分数，并以Lipfetaine2000为比拟，评价制备阳离子脂质体转染服从及细胞毒性.结果：多聚胺阳离子脂质体转染服从略低于Lipfetaine2000，但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体.结论：多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体，在基因转染和基因治疗方面具有较辽阔的远景.【关键词】多聚胺阳离子脂质体；制备；转染0弁言基因治疗可否乐成最紧张的影响因素是基因转染载体.阳离子脂质体能与目的基因以静电作用相结合，可携带的外源基因容量较大,且不含抗原身分，细胞毒性低，可被机体落解，能屡次重复转

3、染，因此成为一种有临床应用潜力的基因转染载体1.多聚胺阳离子脂质体(plyaineatinilipse,PL)易与核酸形成静电复合物而自由通过亲脂性膜，因此，是阳离子脂质体中结果较好的核酸运载载体2.本研究旨在以Invitrgen公司阳离子脂质体Lipfetaine2000为比拟，转染带有加强型绿色荧光卵白EGFP质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞或Hep2细胞，通过荧光显微镜不雅察陈诉基因的表达，评价PL的转染服从，通过TT法检测细胞存活分数，评价廉价PL的细胞毒性.1质料和要领1.1质料ThlSiga，二油酰磷脂酰乙醇胺DPESiga，Lipfetaine2000(Invitrgen)

4、，质粒PIRES2EGFP，感觉态细胞DH5均由我校免疫教研室杨安钢传授惠赠，质粒微量抽提试剂盒安徽优晶生物工程，DE造就基(Gib)，胎牛血清(天津TBD)，24孔造就板range，96孔造就板range，TTAres.1.2要领2结果2.1转染服从评价A：PL转染HeLa细胞后48h；B：PL转染Hep2细胞后48h；：Lipfetaine2000转染HeLa细胞后48h；D：Lipfetaine2000转染Hep2细胞后48h.图1PL或Lipfetaine2000转染PIRES2EGFP入HeLa细胞或Hep2细胞10略aP0.05vsLipfetaine2000组.图2PL,Lipf

5、etaine2000转染PIRES2EGFP入HeLa细胞、Hep2细胞转染服从比力略2.2细胞毒性评价TT法别离比力PL，Lipfetaine2000转染HeLa细胞48h后存活分数，别离为87.44.6%，70.33.0%，经统计学阐发，二者有明显性差异P0.05；检测PL,Lipfetaine2000转染后Hep2细胞48h后存活分数别离为88.23.5%,69.44.3%,经统计学阐发，二者有明显性差异P0.05.结果表白，PL细胞毒性低于Lipfetaine2000.3讨论影响基因转染服从的因素许多3，包罗细胞种类，转染时间，载体布局，脂质体/DNA复合物内部净电荷数目8，脂质体粒径

6、巨细等方面，别的Li等9以为脂质体DNA复合物中两者比例对基因转染服从也有紧张的影响.我们在前期试验中制备四种PL，并根据PL与DNA的差异质量比，通过转染质粒PIRES2EGFP入HeLa细胞，检测转染后差异时间的转染服从和细胞存活分数，创造转染后48h，转染服从最高，阳离子脂质体与DNA结合比例为341时，同时挑选出相对高效低毒PL.本研究使用前期制备并挑选出的PL，接纳前期实行挑选的PL与DNA比例，转染时间等参数，通过转染携带绿色荧光卵白陈诉基因的质粒PIRES2EGFP进入HeLa细胞，Hep2细胞，通过荧光显微镜检测EGFP的表达，反响PL的转染服从，研究创造，本实行制备的PL转染

7、服从略低于Lipfetaine2000.转染HeLa细胞、Hep2细胞，前者转染服从较高，其机制尚不明晰，思量大概与细胞摄取本拥有关，但尚不克不及以为HeLa细胞摄取任何脂质体的本领均强于Hep2细胞.通过TT法检测细胞存活分数，实行创造，转染后48h,PL组较Lipfetaie2000组表示出较小的细胞毒性，思量PL同Lipfetaine2000比拟，其疏水基团前者为胆固醇，后者为两条长链脂肪酸链，而胆固醇身分同细胞膜布局身分雷同有关，因此细胞毒性较小.同时有学者报道，多聚胺胆固醇阳离子脂质以胆固醇基团交换两条长链脂肪酸后，从而亲水基团与胆固醇基团形成“T空间布局3，且与DNA形成的复合物更

8、不变10，从而进步由其构成的载体的转染服从.综上所述，本实行中乐成制备的PLThlDPE31摩尔比具有转染服从较高，细胞毒性较小的特点，在基因治疗方面具有辽阔的应用远景.【参考文献】1Rpert.LipsesasagenedeliverysysteJ.BrazJedBilRes,1999,322:163-169.2LeeER,arshallJ,SiegelS,etal.DetailedanalysisfstruturesandfrulatinsfatinilipidsfrhigheffiientgenetransfertthelungJ.HuGeneTher,1996,714:1701-171

9、7.3JudithK,Guy,VeeraiahB,etal.NvelplyainlipidsenhanetheellularuptakeflignuletidesJ.JBilhe,1995,270:31391-31396.4XiangG,LeafH.AnvelatinilipsereagentfreffiienttransfetinfaalianellsJ.BiheBiphysResun,1991,179:280-285.6hiJS,LeeEJ,JangHS,etal.Neatinilipsesfrgenetransferintaalianellsithhigheffiienyandltxii

10、tyJ.Bihe,2001,12:108-113.7KiYJ,KiT,hungH,etal.TheeffetsfserunthestabilityandthetransfetinativityftheatinilipideulsinithvariusilsJ.IntJPhar,2022,25212:241-252.8韩一生，胡蕴玉，金格乐，等.脂质体介导下重组pDNA3Hbp3转染兔枢纽软骨细胞的条件J.第四军医大学学报，2001,2211:987-990.9Li,IshidaT,kadaY,etal.InreasedgeneexpressinbyatinilipsesTFL3inlungetastasesfllingintravenus