酶免疫技术3课件

1、酶免疫技术第一节 酶免疫技术的特点 基本原理：Ab+E Ab-E+Ag AgAb-E+底物 显色 Ag+E Ag-E+Ab AgAb-E+底物 显色 该实验利用了酶催化底物的生物放大作用，可对标本中抗原（抗体）进行定性、定位和定量分析。相结合的技术酶标记免疫技术又称酶免疫技术：抗原抗体反应的特异性 酶促反应的专一性辣根过氧化物酶 （HRP） 从辣根菜中提取的，糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基），主酶与酶活性无关， 辅基是酶的活性中心。优点：分子量小，标记物易透入细胞；标记方法简单；溶解性好； 价格低且有商品供应；底物种类多。 由于有以上优点，因此，是ELISA最常用的酶 。常用酶酶和酶作用底物H

2、RP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HRPDH2为供氢体习惯上被称为底物，底物有多种 酶和酶作用底物HRP催化的反应式H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。 常用的是过氧化氢（H2O2)和过氧化氢尿素（CH6N2O3) ，过氧化氢很不稳定需用前临时配制。过氧化氢尿素配制成应用液可长期保存。 HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD四甲基联苯胺 TMB5-氨基水杨酸5-ASA 2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS常用底物酶和酶作用底物TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 HRP的常见

3、底物 酶和酶作用底物ELISA试剂盒有两种液态试剂A（过氧化氢），B（TMB），如出现颜色改变应废弃。 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面 三、固相载体第二节酶免疫技术分类 酶联免疫吸附试验（常用）斑点ELISA斑点酶免疫渗滤实验 免疫印迹法高灵敏度ELISABAS- ELISA派生出酶免疫技术的分类酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相测定技术异相测定技术液相法固相法夹心法捕获法竞争性ELISA非竞争性ELISA间接法酶放大免疫测定技术克隆酶供体免疫分析平衡法；非平衡法第三节酶联免疫吸附试验(enzym

4、e linked immunosorbent assay,ELISA) 底物显色定性或定量的分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离1234一、基本原理固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理1、双抗体夹心法应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定，如 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。ELISA检测抗原的方法4、加酶底物1、包被： 包被已知抗体洗涤 去除未结合抗体2、加样：加待测标本 （待测抗原）3、加酶标志物：酶标抗体洗涤去除 未结合物洗涤去除 未结合物，酶标抗体加终止液 5、结

5、果判定：肉眼观察定性分 析；酶标仪检测定性或定量分析 双位点一步法？1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加待检物4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包2、加待检物无抗3、加酶标抗体+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY2、竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）ELISA检测抗原的方法1、间接法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点

6、 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISA检测抗体的方法2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体的方法夹心法：有双抗原夹心法和双抗体夹心法，两者步骤相同，操作原理相同。但酶标志物和检测对象不同。双抗原夹心法测抗体，双抗体夹心法测抗原。3、竞争法原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 ELISA检测抗体的方法捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体ELISA检测抗体的方法洗涤洗涤洗涤洗涤捕获法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY 1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合