实验室规则与安全

1、实验室规则与安全余 蔚1微生物危害程度分级食品中可能存在的微生物分类危害程度菌落总数，大肠菌群和粪大肠菌群I级低个体危害，低群体危害；常见食源性致病菌（沙门，志贺，金葡，单核细胞增生李氏菌等）II级中等个体危害，有限群体危害肉毒羧菌（发酵制品，肉制品），炭疽芽孢杆菌（肉类）等III级高个体危害，低群体危害鼠疫耶尔森氏菌（畜肉），埃尔托生物型霍乱弧菌（海产品，各类食品）等IV级高个体，高群体危害2022/9/252实验室生物安全防护水平BSL（Biosafety Level）分为：I，II，III，IV级，分别以BSL-1，BSL-2，BSL-3，BSL-4表示实验室的生物安全防护水平生物安全实

2、验室分级2022/9/253生物安全实验室的选择II级危害常见致病菌的检测，生化鉴定，免疫实验，PCR提取，涂片，显微观察等均需在BSL-2实验室进行。2022/9/254实验室生物安全防护屏障一级屏障主要包括：各级生物安全柜（用于防护可能生成的含有病原微生物的气溶胶）和个人防护装备二级屏障主要包括：建筑结构，通风空调，给水排水，电气和控制系统2022/9/255生物安全实验室的硬件要求 BSL-2（基础生物实验室 ）可共用建筑物，但应有可自动关闭带锁的门，实验室的门应有可视窗应采用窗户进行自然通风，并应带有防虫纱窗。应配备有生物安全柜，生物安全柜的作用是防护生成的含有病原生物的气溶胶实验室门

3、上应标有国际通用的生物危害警告标志。空气流向：缓冲区-低污染区-严重污染区，每个区之间有-10-60pa的压差，防止空气倒流2022/9/2562022/9/257生物安全柜（BSCs）分级2022/9/258不同保护类型及生物安全柜的选择2022/9/259无菌室的硬件要求墙面及地面应光滑，易于清洁与消毒入口处应设有缓冲间，缓冲间应有紫外灯消毒，并有自动洗手和干手装置推荐温度为20，湿度为40%-60%应配备消毒装置：紫外灯等2022/9/2510微生物实验室进入规范只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。实验室的门应保持关闭。儿童以及与实验无关的动物不应被批准或允许进入实验室工作区域。20

4、22/9/2511无菌室的准备与进入无菌室使用前必须打开无菌室的紫外灯辐照灭菌30分钟以上，并且同时打开超净台进行吹风 。进入无菌室前30分钟应关闭紫外灯，以减少紫外线及臭氧对人体的伤害。进入程序：肥皂（消毒液）洗手换无菌室工作鞋进入缓冲间更换无菌室工作服，带口罩，帽子2022/9/2512人员防护在实验室工作中，任何时候都必须穿着工作服。在进行可能接触到感染性材料的操作时，必须戴手套，手套使用完毕，应先对手套进行消毒再摘除手套，随后必须洗手。在处理完感染性材料或离开实验室之前，都必须先洗手。严禁穿着实验室工作服离开实验室。禁止在实验室工作区域进食，饮水，化妆，戴隐性眼睛。禁止在实验室工作区域

5、储存食物和饮料。实验室工作服和日常服装必须分开放置。2022/9/2513无菌室工作结束后的处理收拾操作台面的废弃物，用容器从传递窗传出。喷75%酒精（消毒液）消毒操作台面，离开。进入缓冲间，脱下工作服，口罩，帽子（一次性口罩，帽子应带出丢弃），换鞋2022/9/2514废弃物的处理程序实验室应配备有普通废弃物和污染废弃物两个垃圾箱，在污染废弃物垃圾箱上应有生物危害标志。废弃物应分类收集：实验室培养物及其污染物应放入污染废弃物垃圾箱内。废弃物的处理与消毒：121，30分钟或以上高压蒸汽灭菌，消毒液灭菌，或者高温灭菌。任何必要的清洗，修复必须在灭菌或消毒处理之后进行2022/9/2515实验室的

6、污染清除程序无菌室：紫外灯消毒：30min（室内温度20，湿度40%-60%）；30min（室内温度40,湿度60%）臭氧消毒：20mg/m3浓度的臭氧消毒时间30min消毒验证：平板计数琼脂平板开盖暴露15min后，转移至36培养48h，计数，要求15cfu2022/9/2516实验室的污染清除程序实验室废弃物：高压蒸汽灭菌是清除污染的首选方法。实验室的培养物，感染材料等应先通过高压蒸汽灭菌（121，30min或以上）处理其他消毒方法：消毒液（70%乙醇，有效氯浓度1g/mL的漂白剂，100mL/L的甲醇等）浸泡，高温消毒等2022/9/2517实验室的污染清除程序生物安全柜：多聚甲醛（空气

7、中浓度达到0.8%）熏蒸6h，比多聚甲醛浓度高10%的碳酸氢铵蒸发后，接通生物安全柜电源，启动2s，使碳酸氢铵循环2022/9/2518实验室的污染清除程序手部污染：大部分情况下，用普通的肥皂和水彻底冲洗手部即可清除手部污染，在高度危险的情况下，建议使用杀菌肥皂。手要完全抹上肥皂，搓洗至少10s，用干净水冲洗后再用干净毛巾或纸巾擦干。没有条件彻底洗手或洗手不方便，应用70%酒精来清除手部的轻度污染。2022/9/2519安全应急程序刺伤，切割伤或擦伤：脱下防护服，用肥皂和大量流水冲洗受伤部位，应尽可能挤出伤口处的血液，70%酒精或其他消毒剂消毒伤口，必要时进行医学处理。潜在危害性气溶胶的释放（

8、生物安全柜外）：所有人员立即撤离，任何暴露人员都应进行医学咨询，在一定时间内严禁人员进入，应在门口张贴“严禁进入”的标志。过了相应的时间后，应在生物专家的指导下清除污染才可以正常使用。2022/9/2520安全应急程序容器破碎及感染性物质溢出：应立即用纸巾或者毛巾覆盖在污染物上，随后在其上倒消毒剂，作用30min后，清理掉布，纸巾及破碎物品，破碎玻璃应用镊子处理，处理用的纸巾，毛巾及破碎物品应放入污染废弃物垃圾箱中，经过消毒处理后再丢弃。所有的操作过程都应戴手套处理。2022/9/2521分子生物实验室硬件要求基因检测实验室分隔的工作区：试剂贮存和准备区，样品粉碎区和准备区，PCR扩增区，扩增

9、产物分析区。工作区工作服，试剂，仪器等必须有明确的标记，避免混用。各实验区域应有专用的仪器设备，同一区域内的仪器设备、物品和工作服应有明显标记，避免与其他区域的仪器设备混用。仪器设备的校准应符合ISO/IEC 17025：1999中5.5的规定。2022/9/2522PCR产物分析区本区是最主要的扩增产物污染来源，应采用负压条件或减压（如排风扇等）条件以减少扩增产物从本区扩散到其他区域。2022/9/2523基因检验实验室进入规范单一方向进入：试剂贮存和准备区样品粉碎区和准备区PCR扩增区扩增产物分析区。不同区域使用不同颜色工作服，工作服不得带出所在工作区域送检样品的包装应完好并有明确的标识；

10、在对实验室样品进行混样、测试样品的制备和称量过程中应避免交叉污染2022/9/2524实验室的污染清除程序实验室空间应定期进行紫外照射。实验台面：10%次氯酸钠或3%双氧水清洁台面实验后紫外灯照射实验台面，照射过夜。实验室的清洁程序应按试剂贮存和准备区样品粉碎区和准备区PCR扩增区扩增产物分析区方向清洁。含PCR产物的任何废液，或污染了PCR产物的吸头等试验用具，应浸泡于1mol/L的盐酸溶液，清除污染后丢弃。2022/9/2525个人防护在整个实验操作过程中要穿实验服，戴手套。紫外线：应佩戴具有紫外线防护功能的护目镜和/或防护面罩，并遮蔽暴露的皮肤。2022/9/2526实验试剂和危害废弃物

11、管理具有毒性，放射性，致癌或致突变性的试剂应有明显的标志使用过的移液器吸头应放入含有10%次氯酸钠溶液的容器内浸泡，浸泡时间不宜少于24 h。含有PCR产物的所有液体及废弃物应放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡时间不宜少于6 h；采用PCR-ELISA方法检测时洗板机洗板所产生的废液应收集至1 mol/L HCl溶液中。对含有EB或经EB浸泡过的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液的处理:KMnO4-NaOH（高浓度），活性炭过滤（低浓度）。阳性质粒宜放入1 mol/L HCl溶液中浸泡，浸泡时间不宜少于6 h。2022/9/2527微生物检验原理2022/9/2528菌落总数食品检样经过处理

12、，在一定条件下（培养温度，培养时间，培养基成分等）培养后，所形成的菌落数。所得到的是嗜中温，需氧或兼性厌氧菌。单位：CFU（Colony Forming Units）检验原理：36平板计数琼脂培养2d2022/9/2529大肠菌群大肠菌群，在36培养2d，能产酸产气的需氧和兼性厌氧的G-无芽孢杆菌MPN最近似值检测原理：LST肉汤初发酵，BGLB肉汤验证2022/9/2530霉菌和酵母在孟加拉红培养基上，36培养5d，观察结果霉菌菌落特征：菌落大、疏松、干燥、不透明，有的呈绒毛状或絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，呈现红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。酵母菌落特征：菌落大而

13、厚，圆形，光滑湿润，粘性，颜色单调。常见白色、土黄色、红色。2022/9/25312022/9/2532沙门氏菌检验原理：前增菌：食品中沙门氏菌含量较少，且常由于食品加工过程使其受到损伤而处于濒死状态，所以对某些加工食品必须经过前增菌处理，使其恢复活力，生鸡蛋和肉类可省略此步骤选择性增菌：沙门增殖，其他大多数细菌收到抑制。生化鉴定：借助于三糖铁、靛基质、尿素、KCN、赖氨酸等试验可与肠道其他菌属相鉴别。血清学鉴定：通过菌种特殊的抗原结构（O抗原为主），可以把他们分辨出来。步骤：复活（前增菌）培养（选择性增菌）分离（平板划线分离培养）鉴定（生化鉴定/血清鉴定）2022/9/2533金黄色葡萄球菌

14、检验原理7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨蛋白肉汤：金葡耐盐性强适宜生长盐浓度为5%7.5%，10%15%能生长 血平板：金葡可产生溶血素，血平板上生长菌落周围有溶血环。 BP平板，Baird-Parker平板：金葡可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油酯和可溶性磷酸胆盐，所以在BP平板上生长菌落为黑色，周围有浑浊带，外层有一透明圈。 金黄色葡萄球菌：黑色菌落，有晕圈和透明环 表皮葡萄球菌：黑色菌落 奇异变形杆菌：褐色菌落 大肠艾希氏菌：被抑制 血凝固酶试验：金葡菌可产生血浆凝固酶，可令血浆中的血浆蛋白酶原变成血浆蛋白酶，使血浆凝固，这是鉴定致病性金葡的重要指标。步骤：前处理增菌分离镜检生化

15、鉴定2022/9/2534志贺氏菌实验原理样品在GN增菌液中增菌68h后，HE或SS及麦康凯或EMB选择性平板进行分离，三糖铁初步生化试验，半固体培养基动力试验，如三糖铁上：斜面阴性，底层阳性，不产气，硫化氢阴性，无动力，可疑为志贺氏菌。步骤：增菌分离培养生化鉴定血清学鉴定2022/9/2535分子生物学方法在微生物检测中的应用PCR方法：有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多种方法。基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技

16、术判断结果。2022/9/2536分子生物学方法病原菌检测系统的优缺点分子生物学方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿，特别是相对国标方面来说。但国外用户反映其假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出结果，与免疫法比没有速度优势目前不少产品已经通过AOAC的认证。2022/9/2537DNA 探针技术DNA 探针技术又称分子杂交技术, 是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性, 对某一特异性DNA 序列进行探查的新技术。DNA 探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA 片断, 该片断可大至寄生虫基因组DNA, 小至20 个碱基。当

17、DNA探针与待测的非标记单链DNA( 或RNA) 按碱基顺序互补结合时, 以氢健将2 条单链连接而形成标记DNA- DNA( 或标记DNA- RNA) 的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统( 放射自显影或酶检测等) 检测杂交反应结果。由于DNA 分子碱基互补的精确性, 单链DNA 探针仅与样品中变性处理的DNA 单链出现配对杂交, 由此决定了探针的特异性;用放射性同位素( 如32P) 或生物素标记探针, 使杂交试验同时具有高度的敏感性。2022/9/2538多聚酶链式反应PCRPCR 的基本原理是在体外对特定的双链DNA 片断进行高效扩增, 故又称基因体外扩增法。首先将靶DNA

18、 双链加热变性为单链, 然后加入两段人工合成的与靶DNA 两端互补的寡核苷酸片断作为引物, 即左端引物和右端引物。该对引物与互补的DNA 单链碱基互补结合后, 在有DNA 聚合酶和4 种dNTPs 底物存在的情况下, 引物沿模板DNA 链按5- 3方向延伸, 自动合成新的DNA 双链。新合成的DNA 双链又可作为扩增的模板, 继续重复以上的DNA 多聚酶链反应。经过2535 次循环, 可将靶DNA 序列扩增近百万倍。PCR技术有快速、特、敏感等特点, 因而该技术在食品微生物检测中具有很大的应用潜力。2022/9/2539基因芯片技术基因芯片技术是上个世纪末诞生的一项新型生物技术。它是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面,微生物样品DNA 经PCR 扩增后制备荧光标记探针, 然后再与芯片上寡核苷