酶切回收连接

1、酶切回收连接第1页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三质粒DNA的酶切第2页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三定义：识别dsDNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶第3页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三类内切酶作用特点能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列4-6bp，具有回文结构 （180度旋转对称结构）Hind 产生5粘性末端A AGCTTTTCGA AAAGCTTTTCGAA第4页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三Sst GAGCTCCTCGAG产生3粘性

2、末端GAGCT CC TCGAG粘端切口第5页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三GTCCAGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口第6页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。3、命名：Hind Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 系 株 序书写方法：前3个字母斜体第7页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三酶活性单位指在限定条件下（温度、Buff

3、er），1hr消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位（unit）。实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，通常是反应过夜。第8页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三酶切反应系统的设计回收DNA通常酶切10g实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。酶通常保存在50%的甘油中 ，使用时甘油浓度必须小于5%，故酶至少稀释10倍。Buffer通常是10，使用时稀释10倍。总反应体积20-50ul，不足用tdH2O补足。第9页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三DNA的量酶的用量（U/C）酶在50甘油中，甘油在总体积的浓

4、度要小于5反应的总体积Buffer的体积水的体积第10页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三 质粒DNA 15l （10g）Hind III (20U/l) 1.5 l 10 缓冲液 E 3l 三蒸水 9l _总体积 30l XbaI（20U/l 1.5 l 加样顺序加样后混匀，短暂离心，使之至管底。第11页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三DNA片段的分离纯化第12页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三四、操作步骤： 关键操作：点样在加样孔正上方，不要进入孔中甚至戳穿孔底加样器一旦按下，就一定保持按住直至加样器离开加样孔，否则会将

5、样品又吸回到tip中，使加样失败第13页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三载体 DNA目的基因第14页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 第15页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三酚抽提法切下含目的DNA的胶块。加入酚，将胶块没过即可。振荡后低温冻结，视温度而定时间。30水浴融化，若体积小，可补加TE。振荡器上振荡。12,000 rpm离心5 min。取上清200l。第16页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三用200l的氯仿：异戊醇抽提（

6、振荡，离心12000 rpm，5 min，取上清）。加20 l NaAc，400 l无水乙醇沉淀DNA，冰冻约30 min甚至过夜。12,000 rpm离心10 min，弃上清。将DNA溶于约30l TE中。第17页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三DNA片段的连接反应第18页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三 DNA 连接酶 ligase 催化DNA 5 磷酸基与 3 羟基之间形成磷酸二酯键(ATP)5533OHPOHPDNA连接酶DNA连接酶第19页，共21页，2022年，5月20日，20点59分，星期三总体积20 l 载体 0.10.2g目的基因：载体mol数= 15：1H2O10buffer载体目的基因ligase总体积20l l l l l l 第20页，共21页，2022年，5月20日，2