DR检测方法及应用

1、HIV耐药性毒株检测方法与应用全军艾滋病检测中心1HIV颗粒艾滋病：Acquired Immunodeficiency Syndroms，AIDS获得性免疫缺陷综合征人免疫缺陷病毒Human Immunodeficiency Virus HIV2HIV的生命周期及药物作用靶位RNADNAHIVNucleus宿主细胞 核苷类逆转录酶抑制剂 (NRTIs)非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs) 蛋白酶抑制剂 (PIs)逆转录酶03抗HIV药物研发和应用取得长足进展共6类34种药物6种固定剂量药物合剂2种进入/融合抑制剂1种整合酶抑制剂5种非核苷类逆转录酶抑制剂11种核苷（酸）类逆转录酶抑制剂9种蛋白

2、酶抑制剂4HIV的耐药性由于HIV的基因发生突变，导致病毒对药物的敏感性下降是抗病毒治疗失败的主要原因5耐药性产生的原因 病毒自身因素 内因 药物的选择压力 外因6高复制速率重组高突变率1 substitution per genome per round7-30 crossovers per genome per round10.3x109 virions per dayHIV-1:人类最大遗传变异的病原体7体内的HIV是彼此不同的一群病毒,全基因组中只有很少的核苷酸是保守的，是复杂的病毒群体（准种 Quasispecies）8耐药性产生：药物选择压力 外因在药物选择压力下，耐药变异株完全取

3、代药物敏感株最快发生在14 至28天内耐药株是在病毒自发性的、高频率的基因突变中产生，在药物选择性的压力下优势复制的结果。9HIV-1耐药突变病毒对抗逆转录病毒药物产生抗性病毒酶和底物的结合能力下降(PI, NRTI, NNTI, EI)磷酸化水平增加 - ATP或焦磷酸盐可以介导切除链末端终止子的反应，从而破除链终止作用，并且可以补偿性增强聚合酶的活性降低病毒复制能力增加病毒对其他抗逆转录病毒药物的敏感性改变抗原表位编码缺陷病毒10耐药是怎样发生的？0敏感毒株耐药毒株药物抑制了敏感毒株的复制耐药株成为优势毒株药物11药物压力时间病毒的动态和耐药性病毒载量和复制速率12耐药是怎样发展的？0野生

4、毒株占优势耐药毒株出现的早期耐药毒株占优势野生毒株耐药毒株13获得耐药病毒的两种途径 - 直接获得: 被耐药病毒感染- 药物选择: 病毒复制过程中可产生随机突变，由于药物压力不 足，导致耐药性突变累积14 ARTOff Rx传播No ART耐药性毒株的出现和传播?原发耐药：从未治疗过的病人的耐药继发耐药：治疗后出现的耐药15原发感染后耐药毒株能持续吗？0野生型毒株耐药性毒株原发感染毒株6个月后分离的毒株24个月后分离的毒株16有些耐药毒株可以持续！0野生型毒株耐药性毒株原发感染毒株6个月后分离的毒株24个月后分离的毒株17HIV-1耐药病毒的传播发生率缓慢增加; 5-25% 抗逆转录病毒治疗(

5、ART)效果降低耐药毒株的传播是病毒的复制适应性和获得耐药毒株的概率二个因素的函数 病毒的复制适应性、病毒抑制的程度以及接受治疗病人危险行为的类型是影响耐药毒株传播的重要因素。 18复制适应性影响耐药毒株的传播在博茨瓦纳，数学模型研究的结果即使获得耐药毒株的概率很高，但如果耐药毒株的复制适应性是野生毒株的一半，到2009年，耐药HIV毒株的流行率也达不到WHO提出的15%的警戒线水平如果耐药毒株的复制适应性与野生毒株相同，到2009年，耐药HIV毒株的传播率将超过警戒限水平 19很多停止抗病毒治疗的病人，由于没有了药物压力，野生毒株取代耐药毒株获得生长优势，这往往伴随着CD4细胞数的下降而抗病

6、毒治疗失败产生耐药的很多病人，尽管病毒未受到有效抑制，但CD4细胞数仍高于治疗前的水平可能耐药毒株的毒力和致病性比野生型病毒低，即使产生了耐药，维持耐药毒株占优势对病人可能也有好处耐药毒株的复制能力与致病特征？20耐药毒株的流行率% of resistant isolatesSan Francisco 总医院新感染病人中耐药毒株的流行率021我国部分地区抗病毒治疗失败病人的耐药谱22病毒-宿主-药物因素对HIV-1耐药毒株产生的影响 病毒: 病毒复制的水平 病毒复制能力 宿主细胞中的病毒库 药物: 对ART治疗的遗传屏障 吸收和排出 组织渗透性 药物活性宿主: 服药依从性 基因多态性：酶的等位

7、基因 CD4 & 辅助受体的水平23促使耐药性病毒株出现的因素病毒载量耐药株出现时间300,0000.130,00013,00010300100301,00024服药依从性与耐药性病毒株病毒学失败率 (%)0204060801009590-9580-9070-80500-1000cp/ml 突变株占病毒准种的20以上 57基因型耐药性检测的局限性多轮PCR扩增检测结果只出现一种基因型；优势主要的变异病毒患者体内有上亿拷贝的病毒，其中的一部分被扩增58基因型耐药检测结果的解释基因型耐药检测报告应包括特定突变临床意义的解释但是:很多突变准确的临床意义仍不清楚突变之间的相互作用使得临床意义的估计更加

8、复杂基因型耐药检测结果还没有标准的解释不能检测劣势毒株 (10-20% )059表型耐药性检测优点：直接定量测定耐药性 结果容易解释 有临床临界值（Cut-off） 可立即检测对新药的耐药性缺点：操作复杂、价格昂贵、耗时长60传统的表型耐药性检测方法分离培养HIVHIV感染性滴度测定定量HIV感染PBMC细胞，培养培养液含系列稀释的待测药物HIV药物敏感毒株测定培养上清液的P24抗原与野毒株比较并计算IC50，61表型耐药性检测分离病毒在药物存在的情况下培养计算IC50传统方法克隆病毒RT、PR基因插入含报告基因的骨架病毒转染细胞在药物存在的情况下培养计算IC50改良方法62表型耐药检测检测病

9、毒在药物存在下的复制能力与传统的细菌药敏试验相似结果报告为对药物敏感性倍数的变化063+转染蛋白酶抑制剂逆转录酶抑制剂感染患者体内病毒基因片段t报告基因PRRTIN荧光素酶A-MLV env DNA耐药表型测试载体DNA耐药表型测试载体DNA 重组病毒法进行 表型检测(ViroLogic PhenoSense)价格Costs $1000/标本检测的重组病毒由患者的pol基因，带有报告基因（荧光素酶）并且env基因缺陷的HIV标准病毒构建重组病毒与双嗜性的鼠白血病病毒（MLV）共转染检测假病毒颗粒对不同稀释度药物的敏感性携带患者pol基因重组病毒IC50 或IC95值 与标准病毒进行比较64表型

10、耐药性检测方法药物浓度病毒抑制率 (%)野生型病毒耐药株1000IC50, WTIC50, MT50耐药倍数IC50 = 50% 抑制浓度结果表达方式:病毒的50%抑制浓度(IC50)及其与野毒株相比增加的倍数65IC50增加的倍数是耐药程度的度量药物IC50增加倍数ZAT 4.03TC 48.1 NVP 1.4DDI 1.4IDV 10倍=高度耐药） 生物学 - 超过未治疗患者体内分离病毒药物抑制浓度的范围临床 - 倍数与临床研究中的病毒复制抑制失败相关673TC耐药株诱导及基因型和表型耐药性检测传代数每代培养天数药物浓度(M)每代IC50 (M)Pol区184密码子184编码的氨基酸IC5

11、0倍数变化00.018bATGMd150.008NDcND250.016NDND350.0320.026ATGM1.4450.064NDND560.1280.15ND8.3660.2560.15ATGM8.3760.5122048ATAIe113777.8861.024NDND972.048NDATAI1074.0962048ATAI113777.868PhenoSense HIV Report069虚拟表型（Virtual Phenotype）基因型ProteaseRTHIV数据库Genotype & Phenotype Data虚拟表型Wild-type HIVResistant HIV0

12、70普遍性抗病毒治疗2012年7月美国健康和人类服务部更新了成人AIDS抗病毒治疗指南，推荐不论CD4细胞计数多少，所有HIV/AIDS患者都应进行治疗，将治疗作为预防的手段之一。2012年7月16日，美国FDA批准Truvada（emtricitabine/tenofovir合剂）用于高危人群HIV暴露前的预防2012年7月22日27日在美国召开的第19届世界艾滋病大会提出了终止AIDS流行的远景71毋庸置疑，抗病毒药物的研发和应用在防治AIDS中取得了显著的成效。但同时，与抗生素在人和动物中广泛使用或滥用导致耐药细菌的类型和数量快速增加一样，抗病毒药物的快速推广应用，导致耐药HIV毒株的出

13、现和传播，不仅影响着抗病毒治疗的效果，导致治疗失败，增加艾滋病相关的死亡，还可能快速消耗有限的药物资源，不利于AIDS防治的长期可持续发展。抗病毒药物还作为一种人为施加的广泛存在的选择压力，深刻影响着病毒的整体变异和进化72由于HIV及其准种的高度变异性、药物种类及其作用机制的多样性，以及基因型和表型检测方法的复杂性，目前，将HIV耐药检测结果整合入临床常规治疗的管理还存在很大问题，耐药检测还未能象其他临床检验一样与治疗有机地结合在一起，制订合理的临床应用指南是耐药检测面临的最大挑战732012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南耐药检测方法的选择目前尚无确定的研究支持哪种耐药检测方法更佳多数情

14、况下推荐使用基因型检测，因其相对操作简便、省时、花费少，在野生毒株与耐药毒株混合存在的情况下具有较高的敏感性如果怀疑有整合酶抑制剂及进入/融合抑制剂的耐药HIV毒株，应将扩增测序的区域扩展至病毒的整合酶区和膜区对有复杂治疗史、怀疑存在复杂耐药突变型的患者，可考虑做表型耐药检测742012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南 耐药检测对象所有进入医学观察的HIV感染者和AIDS患者，不论是否进行抗病毒治疗，都应进行基因型耐药检测752012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南初始抗病毒治疗患者 应进行耐药检测，以指导并制定抗病毒治疗方案耐药毒株能够传播并与初始抗病毒治疗的病毒学应答不理想有关从未经历

15、过治疗的患者也可能携带耐药毒株对这类患者进行耐药检测有助于选择能够取得最大病毒抑制效果的治疗762012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南接受抗病毒治疗的患者 在改变抗病毒治疗方案时、病毒学失败时（HIV RNA1000 copies/ml）及病毒抑制不理想时都应进行耐药检测，以判断是否发生耐药以及对哪种药物耐药，从而指导选择有活性的抗HIV药物后续治疗研究发现，在耐药检测结果指导下制订的抗病毒治疗方案与只根据临床判断制订的治疗方案相比，前者病毒学应答的提高和改善更为显著对于HIV RNA为5001000 copies/ml的患者，检测的难度比较大，但仍应尽量做；对500 copies/ml的

16、患者则不建议做772012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南急性HIV感染者 应进行基线耐药检测，以指导选择能够取得最理想的病毒学应答效果的方案，且首选基因型方法如治疗，不必等待耐药检测结果出来后再服药，拿到检测结果后，如治疗方案不合适再进行调整如不治疗，仍推荐进行耐药检测，以确定是否为耐药HIV毒株的原发感染在不治疗的情况下，耐药毒株可能随着时间减少至检测限下，一旦开始治疗将增加治疗失败的风险。因此，急性期不治疗也应进行耐药检测并记录结果，为以后的治疗提供重要参考782012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南慢性HIV感染者 是否应进行耐药检测，目前意见不一致。因尚不清楚传播获得的耐药毒株回

17、复成为野生毒株可能性有多大传播的耐药突变一般比药物选择出的突变更为稳定，有研究报道在慢性感染者中检测到几年以前传播获得的耐药HIV毒株已有数据显示基线的耐药突变与治疗应答的不理想相关推荐对慢性感染者进入临床观察时进行耐药检测792012年，美国成人AIDS抗病毒治疗指南孕妇开始抗病毒治疗前都应做基因型耐药检测抗病毒治疗的目的是最大程度降低血浆病毒载量并预防HIV母婴传播，首要目的是取得最大程度的病毒抑制孕妇开始抗病毒治疗前都应进行基因型耐药检测，对已接受治疗而HIV RNA仍能够检出的孕妇也应进行检测80HIV-1耐药性检测的时机选择 抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应该在病人仍在服药时或

18、停药后立即（4周内）进行检测 不推荐对病毒载量1000cp/ml的病人做病毒载量检测，因为病毒水平太低很难扩增出目的基因片段81依据耐药结果决定抗逆转录病毒治疗的策略药物效价以及其他药物因素服药依从性和其他患者因素考虑病毒因素和免疫状态考虑患者体内病毒的总体耐药情况考虑患者体内病毒的总体耐药情况基于测序结果制定治疗方案预留一类或以上的药物为以后的治疗作准备将初始方案治疗失败的风险降到最低将后续方案治疗成功的机率增加到最大82HIV-1的耐药性不是全或无的现象，基因型和表型耐药性检测结果解释的困难,需要将体外和体内的资料结合起来分析： 所有抗病毒治疗都是联合用药，他们之间是相互协同的，即对一种药物的敏感性降低并不干扰同一治疗方案中其他药物的抗病毒活性 药物即使有耐药性也可能有益处，因为有耐药性突变的病毒比敏感毒株的复制适应性要差得多 血清中药物的水平，特别是蛋白酶类药物是高度变化的，如果能够提高血清中蛋白酶类药物的浓度，低水平的蛋白酶耐药性有时能够被克服83抗病毒治疗失败的原因很多，包括药物的抗病毒活性不足、服药依从性差及个体药物代谢动力学差异等，耐药只是治疗失败的可能原因之一，并且与其他导致治疗失败的因素密切相关因此不能孤立地看待耐药检测结果，而应将其放在病毒载量和CD4细胞计数的变化、