含RIZ1 PR结构域融合蛋白的原核表达、提纯与功能分析

1、含RIZ1 PR构造域交融蛋白的原核表达、提纯与功能分析摘要目的:表达与提纯RIZ1第1个至第200个氨基酸含PR构造域的活性GST交融蛋白质GSTPR200交融蛋白。方法:设计引物以含人RIZ1DNA全序列的pRIZ1RH质粒为模板克隆获得目的基因片段，测序核对后经ER与Xh双酶切，以正确阅读框架插入一样酶切的pGEX6P3中，经转染与IPTG诱导表达挑选到阳性大肠杆菌克隆并提纯该交融蛋白质。分别采用SDSPAGE蛋白电泳法、质谱分析法及组蛋白甲基化转移酶HT测定法鉴定其性质与功能。结果：获得的纯化交融蛋白质相对分子质量约为47000，其P值明显高于对照组P001，且与作用时间呈正相关。结论

2、:所构建的交融蛋白原核表达系统能有效表达活性GSTPR200交融蛋白，可供大量提取作进一步研究。关键词RIZ1蛋白；PR构造域；表达载体；组蛋白甲基化作用RIZ1是功能性挑选能与视网膜母细胞瘤RB肿瘤抑制因子相结合的蛋白质时别离出来的基因。已发现由于不同启动子的作用，RIZ1可以表达两种蛋白产物，即氨基端含有PR构造域的全长产物RIZ11719个氨基酸，以及除缺少RIZ1氨基末端200个氨基酸包含PR构造域外其余序列与RIZ1完全一样的RIZ21。研究说明，RIZ1而非RIZ2具有肿瘤抑制特性。一般来说，RIZ1定位于人染色体1p36，为多种不同类型人癌组织所缺失2。许多人类肿瘤，如肝癌、结肠

3、癌、神经母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤的组织中出现RIZ1而非RIZ2表达沉默35。我们初步研究也发现，人乳腺癌组织中存在RIZ1RNA表达的改变6。人癌组织和细胞株中RIZ1错义失活性突变均出如今PR构造域内或其附近7。在乳腺癌细胞系、肝癌细胞系中由腺病毒介导的RIZ1表达可以造成细胞G2期阻滞和或细胞凋亡35。更重要的是基因敲除鼠假设无RIZ1表达而仅有RIZ2表达，那么易发生胃癌和B细胞淋巴瘤7。通过以上研究可以确定PR构造域与肿瘤的发生有直接联络，因此，目前认为RIZ1抑制肿瘤的作用与其PR构造域有关。为了更好地研究RIZ1PR构造域的功能与构造，我们采用基因工程技术合成并提纯了RIZ

4、1氨基末端含PR构造域的200个氨基酸的交融蛋白，并初步讨论了其体外功能，现报道如下。1材料与方法11材料pRIZ1RH质粒由本研究组保存；原核表达载体质粒pGEX6P3购自AershaBisienes公司，是一种交融蛋白表达载体，含一个可编码谷胱甘肽S转移酶(GST)的读码框架，其下游有多克隆位点，插入符合相应读码框架的外源基因片段，在IPTG的诱导下可表达出与GST相交融的蛋白质；大肠杆菌1061菌株购自NeEnglandBilabs、大肠杆菌BL21DE3表达菌株购自EDBisienses由本课题研究组保存；PfuDNA聚合酶等PR试剂购自Stratagene公司；PR产物纯化试剂盒(Q

5、IAquikPRPurifiatinKit)、大量质粒提取试剂盒(QIAGENPlasidaxiKit)为QIAGEN公司产品；限制性内切酶ER和Xh购自Ferentas公司；T4DNA连接酶购自NeEnglandBiLabs公司；GlutathineAgarse吸附柱购自Siga公司；人组蛋白H3购自upstate公司；AdensylLethinine，Sethyl3H购自PerkinEler公司；BiRad蛋白测定试剂盒购自BIRAD公司。12PR引物的设计与合成目的基因为含PR构造区的PR200基因片段,位于RIZ1全基因序列的第1600个核苷酸(nt1600)。通过GenBank检索R

6、IZ1的DNA序列，采用DNAStar软件设计PR引物，上游引物GSTPR200P1序列为：5AGAATTATGGAAGTGAGGTTTTTT3，含ER酶切位点及启始密码子；下游引物GSTPR200P2序列为：5TTGAGTATTATGAGAGGTGAAATTGGT3，含终止密码子及Xh酶切位点。引物由Invitrgen公司合成。13目的基因的PR扩增以pRIZ1RH质粒为模板，以GSTPR200P1、GSTPR200P2为引物，采用PfuDNA聚合酶PR扩增目的基因。阴性对照以等量去离子水代替模板。其反响条件为：9513in热启动；9530s，5530s，7260s，30个循环；最后72延伸

7、10in。取PR产物5l，DNAarker1l，经2%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察结果。产物纯化后经ABIPRIST310型基因分析仪PERKINELER测序确认。14重组载体的构建141PR反响产物的纯化将以上PR产物点样于2%的琼脂糖凝胶进展电泳，使用PR产物纯化试剂盒纯化回收，用20l去离子水溶解，取1l在2%琼脂糖凝胶电泳上检查，纯化成功后20贮存。142载体pGEX6P3的制备将原核表达载体pGEX6P3转入大肠杆菌1061菌株。挑取单个菌落培养，用质粒提取试剂盒大量提取质粒DNA，溶解于50l的去离子水中。20贮存。143PR200pGEX6P3原核重组表达载体的构建将纯化后的

8、PR产物和pGEX6P3表达载体同时分别用核酸内切酶ER与Xh双酶切,并分别用PR产物纯化试剂盒纯化，氯仿抽提法回收。在T4DNA连接酶作用下，连接含PR基因片段与表达载体获得了PR200pGEX6P3重组质粒5498bp。15表达重组蛋白阳性克隆的检测与鉴定用PR200pGEX6P3重组质粒转化大肠杆菌BL21DE3表达菌株,涂布含100gL-1AP的LB琼脂平板，37恒温培养过夜，平板上长出较好菌落。挑取阳性菌落接种在10l含青霉素抗性的LB试管中，37剧烈振荡培养过夜。次日按160的比例接种过夜，培养物于15l含青霉素抗性的LB试管中，于37剧烈振荡培养至D600n为0508,均分该培养

9、物为两局部，一局部参加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1lL-1以诱导GSTPR200表达,另一局部不加IPTG作对照，继续培养5h，每隔1h两局部各取1l培养物离心后留沉淀细胞置-70冷冻过夜。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE)法，检测与鉴定可以表达与GST交融的含PR构造区蛋白质(GSTPR200交融蛋白)的阳性菌落。16GSTPR200交融蛋白的提纯与质谱分析挑取GSTPR200交融蛋白表达阳性菌落接种在10l含青霉素抗性的LB试管中，37剧烈振荡培养过夜,次日按160的比例接种于400l含青霉素抗性的LB培养瓶中，于37剧烈振荡培养至D600n为0508，参加

10、IPTG至终浓度为1lL-1以诱导GSTPR200表达，继续培养4050h。离心收取细胞，置-70冷冻过夜。次日用5lPBST重新悬浮细胞，于4温度下超声破碎细胞，利用GlutathineAgarse吸附柱提纯GSTPR200交融蛋白。通过atersirassLT质谱系统aters公司分析该蛋白质的分子量。17纯化GSTPR200交融蛋白的组蛋白甲基化转移酶(HT)活性测定采用BiRad蛋白测定试剂盒检测纯化的GSTPR200交融蛋白浓度后，按组蛋白HT测定法分析该蛋白质的活性8。反响体系如下：总容积为40l，含20lL-1TrisHlpH80，02lL-1Nal，04lL-1EDTA，1lL

11、-1DTT，4g纯化的GSTPR200交融蛋白或GST蛋白阴性对照，5g组蛋白H3，3l165iAdensylLethinine，Sethyl3H。各反响混合物于37孵育1020h后，分别取5l各设3个测定样品，共取15l反响物在P81上点样、冲洗、晾干，采用LS6000I型液闪仪BEKAN公司测定每分钟脉冲数P以说明蛋白质HT活性度。2结果21PR扩增的目的基因PR扩增产物长度为625bp，其中目的基因为600bp，引入扩增产物两端的限制性内切酶识别位点序列、启始密码子与终止密码子识别位点序列及保护碱基长25bp。同DNA相对分子质量参照物相比，PR扩增产物的大小与预测的结果一致图1。图1P

12、R扩增PR200的结果(2%琼脂糖电泳)略Fig1AplifiatinfPR200ithPR(2%agarsegel)1DNAladder；2Negativentrl；3PRprdut22检出的表达重组蛋白阳性克隆经SDSPAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝R250染色观察，包含重组质粒的诱导菌在相对分子质量47000位置出现一蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的蛋白条带要弱得多；含质粒pGEX6P3的诱导菌在相对分子质量27000位置出现一条带。目的基因表达的多肽相对分子质量为19700，与交融蛋白共同表达相对分子质量约为47000，与理论估计值相一致。见图2。图2IPTG诱导转化大肠杆菌

13、BL21DE3菌株表达的SDSPAGE结果略Fig2SDSPAGEshingtheIPTGinduedexpressinfthetransfredEliBL21DE3ells1标准蛋白质；2未诱导的转化pGEX6P3的BL21细胞；3诱导后的转化pGEX6P3的BL21细胞；4、6、8分别为未诱导的三个菌落的转化PR200pGEX6P3BL21细胞；5、7、9分别为诱导后的三个菌落的转化PR200pGEX6P3BL21细胞。每泳道加样量约15g,12%胶。1StandardprtEins;2UninduedBL21ellsfpGEX6P3transfredlne;3InduedBL21ells

14、fpGEX6P3transfredlne;4,6,8UninduedPR200pGEX6P3transfredBL21ellsfthreelnes，respetively;5,7,9InduedPR200pGEX6P3transfredBL21ellsfthreelnes,respetively15gperlane,12%gel23GSTPR200交融蛋白的纯化与质谱分析通过GlutathineAgarse吸附柱提纯的GSTPR200交融蛋白经SDSPAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝R250染色，在相对分子质量47000位置呈现单一的蛋白条带图3。质谱分析可见46980处出现单一峰，进一步明确了该纯

15、化交融蛋白质与预期的分子质量一致图4。图3GSTPR200交融蛋白纯化的SDSPAGE结果略Fig3SDSPAGEshingthepurifiatinfGSTPR2001：标准蛋白质；2：诱导后细胞破碎液；3：通过柱子后的细胞破碎液；4：洗柱液；5，6：蛋白洗脱液。每泳道加样量约15g,12%胶。1Standardprteins；2Induedlysate；3Thrughfl；4ashingfl；5,6Elutins15gperlane,12%gel图4纯化GSTPR200交融蛋白质谱分析结果略Fig4assspetretryanalysisfthepurifiedGSTPR20024GSTP

16、R200交融蛋白对组蛋白甲基化作用采用HT测定法可见，GSTPR200交融蛋白组P孵育1、2h后的3个样本P均值分别为81758、119283明显高于对照组GST蛋白质组,分别为13512、18421，两者差异具有高度显著性P001,且与作用时间呈正相关。3讨论PR构造域是肿瘤抑制因子RIZ1的功能区域，本研究为了原核表达与纯化含该构造域的交融蛋白质GSTPR200交融蛋白，选用了pGEX6P3载体。该载体具有GST交融特征，可利用此标签进展纯化。采用大肠杆菌BL21DE3表达菌的优点在于该菌T7RNA聚合酶基因可受IPTG诱导表达，而且该菌没有膜结合性蛋白分解酶活性，可抑制表达的交融蛋白质分

17、解。本研究通过将重组载体PR200pGEX6P3转入BL21DE3表达菌，成功地构建了GSTPR200交融蛋白的原核表达系统，并提纯了该交融蛋白质。研究发现PR结域可以使组蛋白H3中的第9赖氨酸甲基化，而人癌组织因PR构造域基因突变造成RIZ1甲基转移酶活性降低89。本研究为了理解所获得的GSTPR200交融蛋白是否具有甲基化活性，采用HT测定法对提纯的交融蛋白质进展了检测。由于组蛋白H3与甲基在HT的作用下可形成甲基化组蛋白H3，根据这一原理以3H标记甲基3Hethyl，将其与组蛋白H3及受检测的蛋白一起反响，通过测定P可反映形成的甲基化组蛋白H3的量，以说明该蛋白的HT活性。本研究中纯化的

18、GSTPR200交融蛋白组P比对照组GST蛋白质组明显增高，说明得到的交融蛋白质中PR局部具有HT活性。本研究纯化蛋白的大量获取为进一步研究RIZ1PR区域的构造与功能奠定了基矗参考文献1HUANGSHistneethyltransferases,dietnutrientsandtuursuppressrsJ.NatureReviesaner,2002,2(6):4694762EITHA,BRDEURG,BRUNSGA,etalReprtfthesendinternatinalrkshpnhuanhrse1apping1995J.ytgenetisellGenetis,1996,72(23):1141443HEL,YUJX,LIUL,etalRIZ1,butntthealternativeRIZ2prdutfthesaegene,isunderexpressedinbreastaner,andfredRIZ1expressinausesG2ellylearrestand/rapptsisJ.anerRes,1998,58(19):423842444JIANGGL,LIUL,BUYSEI,etalDereasedRIZ1expressinbutntRI