本科学生综合性实验报告

1、YUNNANNDRMALUNIVERSITY本科学生综合性实验报告学号姓名黄秀敏学院专业、班级应生B班实验课程名教师及职称开课学期2011至2012学年下学期填报时间2011年12月4日云南师范大学教务处编印、试验设计方案实验序号五实验名称I人类淋巴细胞株培养实验时间2011年11月1日至22日实验室生物综合实验室1实验目的能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。练掌握RPMI1640培养基的配制方法。熟练掌握细胞传代培养的操作方法。观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。掌握死活细胞的鉴别原理及方法。实验原理

2、、实验流程或装置示意图实验原理：清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似

3、。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。L-谷氨酰胺:氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养基提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20C冰箱中保存，在使用前加入培养液内。细胞传代培养：当原代培养细胞或细胞

4、系细胞增殖达到一定密度后（一般形成致密单层），则需要做再培养。即将培养的细胞分散后，以适当比例转移到另一个或几个容器中扩大培养，此过程为传代培养。一般将传代培养的累积次数作为传代细胞的代数。悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理,传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞

5、经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以次来区别死活细胞。试验流程：细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）|k培养基的配制细胞传代死活细胞的鉴别实验设备及材料仪器：超净工作台、干燥箱、过滤器、超净工作台、多重蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、微量加样器(移液枪)倒置显微镜、光学显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水

6、器、超低温冰箱二氧化碳培养箱材料：微孔滤膜(直径25mm)、孔径为0.22um、细胞培养瓶、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸pH试纸、微孔过滤器(0.22“m)、注射器、各种规格的Tip、离心管血球计数板、滴管、培养细胞、人类淋巴细胞株试剂：75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、HCl、酚红RPMI1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素、NaHCO3、L-谷氨酰胺三蒸水0.4%台盼蓝溶液台盼蓝(染料)、乙醇实验方法步骤及注意事项方法步骤细胞培养准备工作：清洗新玻璃器皿的清洗：先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。使用过的玻璃器皿的清洗立即进入清水，避免干涸难洗；用洗涤

7、剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；浸酸性洗液过夜；从洗液捞出自来水冲洗1015次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干；包装(牛皮纸或不透水纸)；高压(15磅20min)或干热(160度2h)灭菌；备用。胶塞处理新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。自来水清洗10次用1%稀盐酸浸泡30min。自来水清洗10次，蒸馏水刷洗10次。晾干旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装高压灭菌，可使用。塑料制品的清洗用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍强(次强)酸洗液浸泡26h.自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次浸泡在70%乙醇0.51h,备用

8、。用前从乙醇中取出，在超级工作台内紫外线照射1h。Tip和Tube的清洗新的国产Tip和Tube如用于非RNA提取时可用蒸馏水刷洗，晾干，高压灭菌后使用。用于RNA提取时，用蒸馏水刷洗后再用DEPC水(抑制RNA酶)浸泡过夜晾干，高压灭菌后使用。使用过的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/LNaOH或0.2mol/LHCl溶液中，清水洗过，自来水清洗10次晾干，进洗液224h。晾干，放入饭盒高压灭菌，备用。（五）洗液的配制常用的洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制不同的浓度成分强酸洗液次强酸洗液重铬酸钾63g3150g120g6000g浓硫酸1000ml50000ml200ml10

9、000ml蒸馏水200ml10000ml1000ml50000ml配制方法：（1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。（2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。注意：操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。（六）消毒和灭菌（1）射线消毒灭菌主要使用X、60C。进行消毒灭菌，用于牛血清或塑料制品。（2）紫外线消毒一般用无臭氧型紫外灯。一般20min,71%细菌消灭；40min后79%细菌消灭，60min后86%细菌消灭。紫外线照射时间照射再长也不能10

10、0%灭菌，最多只能达到90%。（3）干热灭菌主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至160度，保温90120min。用于RNA提取实验的用品则需要180度，保温58h.（4）湿热灭菌也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。（5）滤过灭菌用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液。（七）化学消毒法（1）70%（75%）酒精消毒（2）0.1%新洁尔灭消毒（3）来苏儿水消毒（4）0.5%过氧乙酸消毒（5）乳酸蒸汽消毒（6）37%甲醛加高锰酸钾消毒（7）煮沸消毒培养基的配制（一）准备（清洗与灭菌）（二）合成

11、培养基的配制1%酚红：配制0.1mol/LNaOH100ml。称量1g酚红于研钵中，取30ml0.1mol/LNaOH逐渐加入研钵中，尽量研细，然后过滤。过滤后的酚红液加三蒸水至100ml。4C保存。饱和NaHCO3的配制：v称取10g的NaHC03溶于200ml三蒸水中，灭菌后分装于50ml试剂瓶。4C保存。RPMI1640培养液配制：配制50mlRPMI1640培养液：每组称取RPMI1640干粉0.52g，溶于50ml的三蒸水。置于搅拌器上搅拌20min,直到液体变为澄清为止。RPMI1640合成培养基配制：v加入0.1ml1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。配

12、制好的培养基，用时用饱和NaHCO3液调节pH至687.0。溶好以后的培养液在超净台中进行0.22pm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。瓶口封好，-20C或4C贮存。小牛血清的处理新买的新生小牛血清一定要灭活。将买来的新生小牛血清不开封置于水浴锅中56C，30min,期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。处理后的血清贮存于4C。(四)生长培养基的配制双抗：(100000U/ml)v160万单位青霉素/瓶+8ml3DW=20万单位/ml1g链霉素+5ml3DW=200000pg/ml各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22pm过滤至1.5ml离心管，-20C贮存。谷氨酰

13、胺储备液(200mmol/L)：v1.5g的谷氨酰胺溶于50ml三蒸水中(30mg/ml=200mmol/L),0.22pm过滤至1.5ml离心管中。-20C贮存。RPMI1640生长培养基的配制50毫升储备液浓度终浓度RPMI1640培养液44.5谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清510%细胞传代选取拟作传代培养的样本，取0.5mL细胞悬浮液加入等量台盼蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成活率。如果样本成活率高，无污染即可用于传代。用弯头吸管将原代培养瓶内的细胞吹打均匀，注意将那些半贴壁生长的细胞吹打脱离以免在移换容器时丢失。

14、把细胞悬液吸入无菌离心管中，塞紧反口橡皮塞以防止空气污染，用1000r/min离心5min。吸去上清夜，加入适量的培养液，用吸管打匀制成细胞悬液。重复步骤1,计算细胞数，加入适量培养液把最终细胞数调节至1X1053X105个/mL。把细胞悬浮分装至新备的细胞培养瓶中，置于37C二氧化碳培养箱中继续培养。具体操作：每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内然后向细胞培养瓶内接种400ul的人淋巴细胞株原液放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置观察死活细胞的鉴别取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝

15、染液混合，放置lmin。取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。结果记录计算：每毫升原液细胞数=4大格细胞总数/4X10000X稀释倍数细胞存活率（）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数血球计数板的分区与分格1大格=16中格1大格=25中格=16X25小格=25X16小格=400小格=400小格每个大方格边长为1mm,

16、则每个大方格面积为1X1=1mm2。盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1X1X1=0.1mm3lml=1000mm3每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400=l/4000mm3=l/4000,000ml注意事项1、首次传代的细胞因需适应新的环境，可适当增加其接种量，以促进其生存与增殖。2、在对细胞进行吹打时，不要用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。3、传代培养的过程较长，细胞被污染的可能增加，因此，必须严格进行无菌操作。4、注意控制细胞浓度。5、沉淀后的小牛血清不能再使用。6、在供给细胞存活所必需的条件中，除适量的水、无机盐、氨基

17、酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度以外，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。7、小牛血清一定要灭活，除去补体和支原体等有毒物质。可用51C水浴灭活，但不能用高压锅或紫外线消毒。5、实验数据处理方法Spssl7.0中文版单因素方差分析6、参考辛华主编.现代细胞生物技术.北京：高等教育出版社，2009.129138章静波等主编.细胞生物学实验技术.北京：化学工业出版社，2006.6370丁勇，许瑞安主编.细胞生物技术实验指南.北京：化学工业出版社，2009.124130丁明孝等主编.细胞生物学实验指南.北京：高等教育出版社，2009.83865安利国，邢维贤主编.细胞生物学实验教程

18、.北京：科学出版社，2010.6465二实验报告1、实验现象与结果淋巴细胞是一种悬浮型生长细胞，在培养过程中几乎不贴附于支持物上，而成悬浮状态生长。在实验现象上，没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大，在原淋巴细胞团的周围可见新生细胞长出。在倒置显微镜下，可以观察到淋巴细胞在实验培养下，明显地增多。其生长过程分为四个期：游离期、繁殖期、维持期、衰退期。镜检，从培养箱中取出的培养液变黄，在光学显微镜下，可见淋巴细胞呈球状，死细胞或不健康的细胞被染成蓝色，活细胞不被染色。2.对实验现象、实验结果的分析及其结论实验现象及结果的分析（一）

19、在淋巴细胞培养过程中，细胞逐渐增多培养液变黄并出现了四个生长期有以下解释：游离期：淋巴细胞在原培养瓶中加以分离，经稀释后接种到新的培养瓶中，由于原生质收缩和表面张力以及细胞膜的弹性，细胞呈圆形，折光性强，悬浮状态。繁殖期：淋巴细胞在丰富的营养状态下，快速生长、分裂，形成细胞岛直至单层。细胞透明，颗粒少，细胞之间界限清楚。维持期：细胞形成单层后，生长与分裂减缓，折光性减弱，细胞内颗粒增多，由于代谢物的积累，C02增多，培养液变黄。衰退期：由于营养缺乏、代谢物积累，细胞内颗粒进一步增多，立体感变差，细胞皱缩，细胞开始衰老直至死亡。（二）死细胞或不健康的细胞质膜已经失活或活性变差，质膜通透性变强，染

20、液由此进入细胞内，使得细胞被染成蓝色。而活细胞质膜具有很强的选择透性，染液不易渗入细胞内，故不被染色呈透明状。三)相关器皿的清洗方法及注意事项器皿种类清洗步骤新玻璃器皿先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。从洗液捞出自来水冲洗1015次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干；(3)包装(牛皮纸或不透水纸)；高压(15磅20min)或干热(160度2h)灭菌；备用。旧玻璃器皿(1)立即浸入清水，避免干涸难洗；(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；(3)浸酸性洗液过夜；(4)从洗液捞出自来水冲洗1015次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干；(5)包装(牛皮纸或不透水纸)；高压(15磅20min)或干热(160度2h)灭菌；备用。注意：在刷洗过程中，不留死角。浸泡时，器皿要充满清洁液，勿留气泡。胶塞(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。自来水清洗10次用1%稀盐酸浸泡30min。