基因工程讲稿

1、关于基因工程第一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月第四节 目的基因制备和常用分离方法 一、已知基因的获得：（一）人工合成根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。适用于合成分子量较小的目的基因（100bp以内）。 第二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月（二）聚合酶链反应（PCR）P333图8-161、定义： 又称基因体外扩增；是在引物的介导下，通过变性、退火、延伸三步循环反应，体外快速的DNA特异性扩增技术。第三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 PCR技术的发明者第四张，PPT共六十五页

2、，创作于2022年6月DNA Replication:第五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 5 3dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPDNA-pol3TemplatePrimer5DNA Replication:3第六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月2、PCR反应原理模拟体内DNA复制过程，通过变性、退火、延伸三步反应的循环完成，靶基因的双链DNA变性为单链，特异的引物在退火过程中与单链DNA模板聚合，在靶DNA的指导下引物的3末端延伸靶DNA的互补链，完成一个循环。理论上，每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，DNA分子扩增为2n；高温变性

3、：94，目的基因接连为单链，以作为扩增的模板； 低温复性：5560，一对特异性引物分别与模板3端互补结合； 适温延伸：72，延伸反应；第七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月第八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 5 5Template DNA5Primer 15Primer 2 5 555The 1st cycleThe 2nd cycle 5 5555555第九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月第十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月平台期指数扩增期到达平台期所需PCR循环次数取决于模板拷贝数、PCR扩增效率及DNA聚合酶的种类及活性.第十一张，PPT共六十五页

4、，创作于2022年6月3、PCR产物特异性模板序列：应使用纯度和浓度较高的DNA模板；引物：优化引物的设计使用较高的退火温度，较少的循环次数； 使用较低浓度的引物、酶和镁离子； 第十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月4、PCR反应体系模板：DNA或RNA(逆转录合成cDNA)DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶缓冲液系统：Tris-HCl,KCl,Mg2底物：相同浓度的dNTP引物第十三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月5、PCR的主要用途目的基因的克隆基因的体外突变DNA和RNA的微量分析DNA序列测定基因突变分析第十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月PCR仪器设备：

5、自动移液器和枪头微量离心管PCR仪电泳设备Simple and rapid operation Wide applicability第十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月二、未知基因获得(一)基因组DNA文库：P336图817 采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。第十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月基因文库（gene library）(G-文库)：是含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。基

6、因文库含有基因组内全部基因片段，包括外显子和无表达功能的内含子序列。每一个克隆只含有一个基因片段，应用时利用探针，从文库中钓取含有所需目的基因的克隆。 第十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 （二） cDNA文库 将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为 cDNA文库。第十八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月cDNA文库(C-文库)：是以mRNA合成的互补cDNA的随机片段的重组DNA克隆群。cDNA文库不含内含子序列，易于表达。具有组织细胞特异性：

7、不同组织细胞、不同发育阶段，基因表达的情况都不相同，应选择特异表达的细胞及状态；C-文库比G-文库小得多，更容易筛选。第十九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月第五节 载体DNA与目的基因的连接 载体的选择（主要考虑以下5个条件）1.有足够容纳目的基因的幅度根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的载体2.构建DNA重组体的目的克隆选克隆载体，表达选表达载体3.载体MSC中的酶切位点根据克隆外源DNA的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型5.载体克隆位点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配 第二十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 DNA分子的体外重

8、组过程示意图第二十一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月一、黏性末端DNA片断的连接：当在载体和目的基因上有相同的限制酶酶切位点时，用同种限制酶（或同尾酶）使二者产生相同的黏性末端，从而将二者连接。第二十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接 G G A T C CC C T A G GBamH的识别序列及切割部位G G A T C CC C T A G GBamH含目的基因的DNA片段BamHGC C T A G535335535353G G A T C CC C T A G G G A T C C G目的基因片段混合、退火G C C

9、T A G G A T C C G G A T C C GG C C T A G质粒载体含目的基因的重组质粒G C C T A G G A T C C GDNA连接酶第二十三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月1 、插入失活法（单酶切）将外源目的基因插入载体选择性标记处，并使其失活。P340图820质粒pBR322的抗性基因筛选示意图第二十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 插入失活示意图 第二十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月2、定向克隆法（双酶切） 为实现定向克隆，可采用两种不同的限制酶同时酶切，使目的基因两端具有不同的黏性末端；定向克隆法构建重组分子P341

10、第二十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 双酶切DNA片段粘性末端的连接 G G A T C CC C T A G GBamHBamHBamHG C C T A G53535553533G A A T T CC T T A A G A A T T C G目的基因片段混合、退火G C T T A A G A T C C G A A T T C GG C C T A G重组质粒DNA连接酶EcoRIEco RI5 G A T C C G G C T T A A A A T T C G G C C T A G G A T C C G G C T T A AEcoRI GATCC G G C

11、CTAG35载体第二十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月3、载体5端脱磷法 载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5端的磷酸基团防止载体的自身环化。重组分子在体内修复缺口 P342图822第二十八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月二、平末端DNA片断的连接：在载体和目的基因上没有相同的限制酶酶切位点时，采用平末端连接。1、由连接酶进行的连接：限制酶直接切割生成平末端，或用核酸酶S1切去黏性末端的单链部分；P310 在连接时，所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度要比连接粘末端的高些第二十九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月2、同聚物尾连接：P343图823利用末端转移酶在

12、载体和目的基因的3OH上加上互补的同聚物尾，两者重组后，空隙由DNA聚合酶填补。 第三十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月加入同聚体尾（homopolymeric tail）连接 TdT：末端转移酶，可将某种单一脱氧核苷酸逐一加到 3- OH上去。底物：3 粘性突出末端 第三十一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月3、人工接头法：P343图824 人工接头（linker）：也称衔接物，是用化学方法合成的一段由1020个核苷酸所组成的，具有一个或几个限制酶识别位点的平头末端双链寡核苷酸短片段。人工接头法：用连接酶将人工接头分子连接在目的基因的末端，再用相关的限制酶切割就可以使目的基

13、因产生黏性末端。双衔接物法构建重组分子P344图 第三十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月连接物分子连接平末端的DNA片段示意图5335G G A T C CC C T A G G3553BamH接头多核苷酸激酶连接酶53G G A T C CC C T A G G35G G A T C CC C T A G GBamH切割G C C T A G53 G A T C C G53BamH切割的质粒载体5353G C C T A G G A T C C GG C C T A G G A T C C G G A T C C GG C C T A G重组质粒目的基因第三十三张，PPT共六十五

14、页，创作于2022年6月第六节 重组分子引入受体细胞 一、受体细胞的选择 1、原核/真核表达系统； 2、克隆/表达； 3、限制和修饰：应为限制酶缺陷型（R-），重组缺陷型（Rec-）； 4、互补功能：敏感型，营养缺陷型； 5、易于转化或转导； 6、感染寄生缺陷型。 第三十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月其他：7.遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。8.内源蛋白水解酶缺失或蛋白酶含量低细胞，有利于外源蛋白质在胞内积累。9.具有较好的翻译后加工机制。第三十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月二、受体细胞的类型1、原核表达系统：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌；2、真核表达系统：酵母

15、、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞（组织培养细胞、胚胎干细胞）； 第三十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月三、受体细胞的感受态 重组DNA导入大肠杆菌的转化效率的高低与受体的感受态有关。 1、感受态细胞：细胞膜结构改变、通透性增加、具有摄取外源DNA的能力的细胞。 2、制备感受态细胞的方法：冰浴中，用一定浓度的CaCl2处理。 第三十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月四、重组子导入细胞的方法1、转化：重组质粒导入受体细胞的过程。2、转染：重组DNA包装成病毒颗粒再来 感染受体细胞。3、微注射技术；4、电转化法；5、基因枪技术；6、脂质体介导法； 第三十八张，PPT共六十五页

16、，创作于2022年6月转化（transformation） 定义： 将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。过程：细胞低温CaCl2处理感受态细胞加重组DNA42热休克重组体吸入细胞复苏涂板（含抗生素）筛选转化菌落。其它方法：电转化、PEG法等。 第三十九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 重组DNA转化过程示意图第四十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月转染（fection） 以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（transduction）

17、。 转染效率转化效率 第四十一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月显微注射法 使用机械的方法直接将外源DNA注射到细胞核或细胞质的方法。第四十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月第七节 重组体的鉴定和分析 阳性重组子的鉴定和筛选 根据遗传标记表型特征：抗药性、互补、营养标记； 根据重组子结构特征：大小、酶切图谱、PCR扩增、核酸分子杂交、DNA测序； 根据重组子表达产物：免疫分析筛选； 第四十三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月一、生物学方法（一）表型筛选法1、双抗生素筛选法结合载体上所含有的原核抗药性标记，利用抗生素和选择培养基（不完全培养基），十分便于筛选阳性重组子。

18、适用于含2个的抗性标记的质粒。例如pBR322，含Tetr（BamHI位点）和Ampr基因，外源DNA插入，使Tetr灭活。 用分别含Ampr 和Tetr的平皿同时筛选，可鉴定出重组子。第四十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月2、半乳糖苷酶筛选法a 互补（ a- complementation） 某些质粒（如PUC系列），含有大肠杆菌的lacZ基因片段，在该基因区又有MCS，这些质粒将导入 lacZ- 的宿主菌中表达。 如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的 半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blue clony。

19、如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体不可能互补产生 半乳糖苷酶，产生white clony。第四十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月a 互补筛选重组体示意图第四十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月3、营养标记筛选法例如酵母人工染色体上的TRP1H URA3基因，分别是酵母色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型trp1-和ura3-的野生型等位基因，在相应的缺陷型酵母细胞中作为选择标记；第四十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月（二）噬菌斑形成筛选法：含有外源基因的噬菌体载体可以形成噬菌斑，反之不能。（三）遗传互补法利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 利用表达

20、产物与宿主细胞中营养缺陷突变发生互补。（四）利用报告基因筛选植物转化细胞第四十八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月二、核酸分子杂交：1、原理：利用序列互补的单链DNA和RNA可利用碱基配对产生氢键而形成杂交分子的特性，检测核酸分子中特异性序列的存在。2、类型：菌落原位杂交；DNA印迹分析；RNA印迹分析；斑点杂交和狭缝杂交； 第四十九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月三、免疫学方法用表达产物的抗血清或McAb进行筛选第五十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 四、PCR技术 针对插入重组体中的目的基因，设计一对引物，进行菌落PCR，如能扩增出条带，则为阳性克隆。第五十一张

21、，PPT共六十五页，创作于2022年6月 五、酶切鉴定 挑选单个菌落扩大培养小量快速提取质粒酶切（根据插入片段上的酶切位点选定）分析有无插入片段、插入片段大小及数量、插入方向等。 第五十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月六、序列分析双脱氧终止法测序（Sanger法）链末端终止法的原理：P3541、利用DNA聚合酶，以单链DNA为模板，以dNTP为底物，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影检测后识读待测DNA序列。第五十三张，P

22、PT共六十五页，创作于2022年6月2、引入双脱氧核苷三磷酸（2,3-ddNTP）作为链终止剂，2,3-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于其3位又少了个羟基。其5 Pi可以和多核苷酸链的3羟基形成磷酸二酯键，但3不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止于ddNTP。第五十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月3、如果在DNA的合成反应中，在4种正常的dNTP之外，再加入一种少量的ddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列长短不一的核苷酸链。第五十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月4、在4组独立的DNA合成反应

23、中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别终止于每一个A、G、C、T的位置上。对这4组核苷酸链同时进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列第五十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月序列测定Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法。第五十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 第八节 克隆基因的表达一、表达系统分类（一）按克隆基因与受体 细胞不同组合分为4类 1.原核基因在原核细胞中表达，例基因工程生产各类工具酶 2. 原核基因在真核细胞中表达，如-gal在昆虫细胞中表达 3.真核基因在原核细胞表达，如IL-2,INF-等 4. 真核基因在真核细胞表

24、达，如人-干扰素和-干扰素在昆虫细胞中表达， -干扰素在小鼠细胞表达（二）按受体细胞表达类型分2类 1、原核细胞表达系统（大肠杆菌、枯草杆菌等） 2、真核细胞表达系统（酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞）第五十八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月二、克隆基因在大肠杆菌中的表达（一）困难 1、缺乏E.coli RNA聚合酶识别的启动子 2、无SD序列，不能与E.coli核糖体小亚基16srRNA结合，不能翻译 3、真核基因较大，有内含子，原核生物无剪接内含子的功能 4、 原核细胞缺乏真核细胞特有的蛋白修饰系统 5、真核蛋白易被E.coli蛋白酶水解 6、原核细胞无法切除信号序列等结构。第五十九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月 （二）构建策略： 一）目的基因：表达真核基因必须克隆cDNA片段,表达分泌蛋白必须去除真核信号肽序列,ATG的5端非编码区必须去除二）载体选择：必须是大肠杆菌的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。商用载体已含P