实验五-感受态制备与转化-酶切电泳

1、实验五感受态的制备、质粒的转化和筛选2015-10-30实验安排感受态的制备质粒的转化第二天，观察结果质粒酶切-电泳检测 上次实验产物（质粒） 酶切电泳点样安排电泳上样：1、所有同学各自的酶切产物（10-20 l）2、每排点样孔需有两种质粒：pUC119、pUC119-U63、同一人的“酶切前”与“酶切后”相邻点样实验步骤加1.5ml培养物于EP管，4000rpm10min 加入冰冷CaCl2溶液300 l，重悬菌体 沉淀中加入冰冷CaCl2溶液120 l，重悬菌体感受态制备冰浴15-30min， 4000rpm10min收集沉淀，去上清收集沉淀，去上清（去掉培养基）实验步骤每管感受态中加质粒

2、5 l，混匀42 ，热激90秒，勿摇动每管加LB 500 l，37摇床，复苏30-40min 铺200 l 菌液到LB琼脂平板，涂匀转化冰上静置20-30min如何设计实验的参照体系（对照组）？筛选实验步骤LB培养基（X-gal, IPTG, Amp）LB培养基感受态+质粒（ pUC119-U6 or pUC119）感受态（无质粒）pUC119-U6pUC119对照组B？对照组A？基因克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出

3、含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称DNA克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 基因克隆示意图基因克隆操作过程： 分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体菌 筛筛选重组体 受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent) 导入方式转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection)重组DNA导入受体菌LB 0.18M0.1M CaCl20.1M CaCl2H2O细胞膨胀：低渗环境胞膜收缩：低温环境离子扩散： DNA-Ca2热休克： 42 1L LB

4、培养基:10g 胰蛋白胨5g 酵母提取物10g NaCl 重组体的筛选重组DNA导入受体菌后，经过培养使其大量繁殖，再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来，这一过程即为筛选（screening）或选择（selection）。重组体的筛选 1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker rescue) 互补（蓝白斑筛选）(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹 2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等 互补的检测蓝白斑筛选感受态细胞转化效率的检验1g的完整质粒转化到感受态细胞中，得到的转化细菌的数量。例如，取1l（0.1 ng/l）完整的质粒转化100l的感受态细胞. 向转化反应液中加入900l培养液，让细菌恢复一小段时间，取100l铺板.培养过夜，产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000l后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒。转化率1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/g转化效率1106 cfu/g DNA可满足普通的亚克隆实验；11