人教版教学酶的生产条件的优化以及常用酶的应用市公开课获奖课件

1、第二章 酶生产 The production of Enzyme 1第1页第1页一、酶生产办法 1、 提取法 (Extraction) 酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中，能够直接从生物体中分离提纯而取得，早期酶生产多是以动植物为主要原料提取而得。 动、植物等原料中提取。例：胰脏胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶； 动物胃胃蛋白酶； 动物小肠碱性磷酸酶； 木瓜木瓜蛋白酶； 菠萝皮菠萝蛋白酶； 柠檬酸发酵废菌体果胶酶 等。第2页第2页利用动物、植物细胞和组织培养办法来生产酶，由于周期较长、成本较高，也存在一定难度。50年代以来酶生产主要办法。80年代以来，植物细胞或动物细胞发酵。主要方式：

2、固态发酵和液体发酵法2、发酵生产法 (Biosynthesis)第3页第3页1、氧化-还原酶（1）葡萄糖氧化酶（起源于霉菌）（2）D氨基酸氧化酶（起源于霉菌、肾脏）（3）尿激酶（起源于酵母菌、肾脏）（4）过氧化氢酶（起源于细菌、霉菌、红血球）（5）近氧化物酶（起源于植物）2、转移酶（1）转氨基酶（起源于细菌、动物肝脏）（2）核苷磷酸转移酶（起源于细菌）3、水解酶脂肪酶（起源于细菌、霉菌、胰脏）5-磷酸二酯酶（起源于霉菌）淀粉酶（起源于细菌、霉菌、胰脏、麦芽）果胶酶（起源于细菌、霉菌）纤维素酶（起源于霉菌、蘑菇）半纤维素酶（起源于霉菌）溶菌酶（起源于细菌、鸡卵白）蜜二糖酶（起源于霉菌）乳糖酶（起

3、源于细菌、霉菌）转化酶（起源于细菌、酵母）透明质酸酶（起源于细菌、动物睾丸）凝乳酶（起源于霉菌、小牛胃、羊胃）天冬酰胺酶（起源于细菌）脲酶（起源于豆科植物）青霉素酰化酶（起源于细菌、霉菌）氨基酰化酶（起源于细菌、霉菌、牛肾脏）橙皮苷酶（起源于霉菌）蛋白酶（起源于霉菌、放线菌、动物内脏、植物瓜果）第4页第4页4、裂合酶裂合酶天冬氨酸-脱羧酶（起源于细菌）-酪氨酸酶（起源于细菌）延胡索酸酶（起源于细菌）谷氨酸脱羧酶（起源于细菌）5、异构酶氨基酸消旋酶（起源于细菌、霉菌、酵母）葡萄糖异构酶（起源于细菌、放线菌第5页第5页（1）酶液体发酵生产普通过程液体酶制剂生产流程图第6页第6页微生物种类多、酶种丰

4、富;微生物生长繁殖快，酶易提取;微生物培养基起源广泛、价格廉价;酶发酵生产过程可实现规模化连续化。（2）微生物产酶长处第7页第7页3、化学合成法：60年代中期出现新技术。人工合成酶办法 1969 年，美国初次用化学合成法得到含有124个氨基酸核糖核酸酶。要求氨基酸纯度高，合成成本高昂。至今停留在试验室阶段。当前还受到试剂、设备条件限制。第8页第8页1、中心法则（Central Dogma ）二、酶生物合成过程Reverse transcription第9页第9页2、RNA生物合成(转录)- Transcription 在RNA合成中，DNA二条链中仅有一条链可作为转录模板，称为转录不对称性。

5、转录所需酶 依赖DNARNA聚合酶又称为转录酶。 原核生物转录酶由1种RNA聚合酶催化所有RNA生物合成。 真核生物中RNA聚合酶分别为RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶3种，它们都属于寡聚酶，酶亚基数目为410个，亚基种类有46种。第10页第10页过程：RNA聚合酶 DNA开启基因，DNA双螺旋部分解开，以其中一条链为模板，经过碱基互补方式结合进入第一个核苷酸，然后，RNA聚合酶移动，DNA逐步解开，按模板碱基次序逐一加入核苷酸并聚合成多聚核苷酸链。转录成RNA按结构和功效不同分为mRNA,tRNA和rRNA。RNA聚合酶第11页第11页3、翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核

6、糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子，合成多肽。分四个过程：A、氨基酸活化生成氨酰-tRNA B、肽链合成起始C、肽链延长D、肽链合成终止第12页第12页A、氨基酸活化生成氨酰-tRNA氨基酸在氨酰-tRNA合成酶作用下，与特定tRNA结合，由ATP供应能量；第13页第13页AAULeucineACUAsparticAcidAUGThreonineTRANSFER RNAAMINO ACIDS第14页第14页AAULeucineACUAsparticAcidAUGThreonineAmino acids combine with the tRNAs using the energy from

7、the splitting of ADP.第15页第15页AAULeucineACUAsparticAcidAUGThreonineAmino acids combine with the tRNAs using the energy from the splitting of ADP.第16页第16页AAULeucineACUAsparticAcidAUGThreonineANTICODON第17页第17页B、肽链合成起始：在GTP和起始因子参与下核糖体30S亚基、甲酰甲硫氨酰-tRNAF（fMet-tRNAF）、mRNA 和 50S亚基结合构成起始复合物。第18页第18页30S与起始因子I

8、F3结合；30S与mRNA结合形成30S- IF3-mRNA复合物；fMet-tRNAF与起始因子IF2以及GTP结合；过程可分为五个阶段进行：第19页第19页在起始因子IF1参与下，fMet-tRNAF -IF2-GTP与30S- IF3-mRNA结合生成30S起始复合物，fMet-tRNAF正好位于mRNA起始密码子AUG上；第20页第20页50S与30 S起始复合物结合，形成含有完整结构70S 核糖体。同时放出IF1 、IF2 、IF3并使GTP水解生成GDP和Pi； 第21页第21页C、肽链延长：在延伸因子参与下，与mRNA上密码子相应氨酰-tRNA进入70S核糖体之中“A”位。 第2

9、2页第22页通过肽合成酶作用，P位上fMet-tRNAF甲酰甲硫氨酰(fMet)与A位上氨酰-tRNA(aa1-tRNA：)以肽键结合，形成肽酰-tRNA。 第23页第23页mRNA和核糖体作相对移动，A位上肽酰t-RNA转至P位，而原在P位上t-RNAF游离出去。然后下一个氨酰-tRNA进入A位，再重复上述过程，使肽链不断延伸，直至终止密码子为止。 第24页第24页D、 肽链合成终止：伴随肽链延伸，mRNA与70s核糖体不断地作相对移动。当mRNA分子中终止密码子(UAA，UAG，UGA)移动到核糖体A位时，没有相应氨酰-tRNA进入，此时释放因子(Release Factor)进入A位，并

10、与终止密码子结合。第25页第25页新合成肽链释放出来需通过加工形成完整空间结构酶或蛋白质。先通过肽脱甲酰酶作用，使甲酰甲硫氨酸残基上甲酰基除去。有时还需在氨肽酶作用下从肽链N-末端切除一个或数个氨基酸残基。然后自动折迭弯曲成完整空间结构。第26页第26页三、酶生物合成调整 雅各布(Jacob)和莫诺德(Monod)于1960年提出操纵子学说来阐明酶生物合成调整。操纵子调整基因Regulator gene启动基因Promoter gene操纵基因Operator gene结构基因Strutural gene第27页第27页（1）基因调控模式3种调控模式：分解代谢物阻遏作用；酶合成诱导作用；酶合成

11、反馈阻遏作用。 第28页第28页 1 ）分解代谢物阻遏作用易利营养基质代谢使细胞内ATP浓度增长，从而使AMP浓度减少。cAMP可通过磷酸二酯酶水解成AMP致使cAMP浓度之而减少。cAMP-CRP复合物浓度跟着减少。结果，在启动基因(P)上没有cAMP-CRP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到启动基因位点上。结构基因(S)上遗传信息无法转录，酶合成无法进行。第29页第29页当易利用基质不存在或用完后，伴随细胞中ATP浓度下降，而使ADP，AMP，cAMP浓度增长。当cAMP-CRP浓度增长到一定量时候，cAMP-CRP复合物结合到启动基因特定位点上，RNA聚合酶也伴随结合到它位点上，酶生

12、物合成就有也许进行。第30页第30页2）酶生物合成诱导作用无诱导物时，阻抑蛋白与操纵基因结合较强，启动基因上RNA 聚合酶无法进入结构基因上转录，酶不能合成。有诱导物时，诱导物与阻抑蛋白结合，阻抑蛋白结构改变，不能与操纵基因结合，RNA聚合酶可进行转录生成mRNA，再进一步翻译成酶蛋白多肽链。第31页第31页3）酶生物合成反馈阻遏作用当没有共阻遏物（酶催化产物或路径末端产物）时，阻抑蛋白不能与操纵基因结合，启动基因上RNA聚合酶能顺利通过操纵基因位置，结构基因进行转录，进而合成酶蛋白多肽链。 当有共阻遏物时与阻抑蛋白特异结合形成完全阻遏物，与操纵基因亲和力增强，制止RNA聚合酶通过，结构基因无

13、法转录，酶合成受阻。第32页第32页四、酶生物合成模式细胞生长过程：调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段比较细胞生长与酶产生关系, 酶生物合成模式分为：同时合成型、延续合成型、中期合成型和滞后合成型。 第33页第33页1、同时合成型 酶生物合成与细胞生长同时进行。酶合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。属于该合成型酶，细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶合成伴随停止。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度 活细胞浓度胞外酶浓度 胞内酶浓度大部分构成酶生物合成属于同时合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。 比如米曲霉在含有单宁或者没食子酸培

14、养基中生长，在单宁或没食子酸诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20）。 第34页第34页2、延续合成型 酶生物合成在细胞生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还能够延续合成一段较长时间。 属于该类型酶能够是构成酶，也能够是诱导酶。比如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源培养基中培养，能够诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）生物合成。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物 以含有葡萄糖果胶为诱导物 第35页第35页3、中期合成型 该类型酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长

15、进入平衡期以后，酶生物合成也伴随停止。 细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml比如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)生物合成模式属于中期合成型。由于该酶合成受到其反应产物无机磷酸反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺营养物质，培养基中必须有磷存在。在细胞生长开始阶段, 培养基中磷阻遏碱性磷酸酶合成，只有当细胞生长一段时间， 培养基中磷几乎被细胞用完（低于0.01 mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所相应mRNA不稳定，其寿命只有30 min左右，因此当细胞进入平衡期后， 酶生物合成伴随停止。第36页第36页4、滞后合成型 这类型酶

16、是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶生物合成都属于这一类型。酶合成受到培养基中存在阻遏物阻遏作用。只有伴随细胞生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。 若培养基中不存在阻遏物，该酶合成能够转为延续合成型。该类型酶所相应mRNA稳定性较好，能够在细胞生长进入平衡期后相称长一段时间内，继续进行酶生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 放线菌素D 对产酶影响细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml3022不加加入不加加入第37页第37页5、抱负酶合成模式mRNA稳定性好，平衡期以后继续合成酶；不受阻遏物影

17、响；生产中，最抱负合成模式应是延续合成型。同时合成型要尽也许提升其对应mRNA稳定性，为此适当降低发酵温度是可取办法；滞后合成型要设法降低培养基中阻遏物浓度 ，尽也许降低甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶生物合成提早开始；中期合成型则要在提升mRNA稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成开始时间提前， 并尽也许延迟其生物合成停止时间。第38页第38页6、酶生产过程中细胞生长动力学 细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境原因对细胞生长速度影响规律。1950年，法国 Monod首先提出了表述微生物细胞生长动力学方程。 在培养过程中， 细胞生长速率与细胞浓度成正比 。假设培养基

18、中只有一个限制性基质，而不存在其它生长限制原因时，为这种限制性基质浓度函数。KS 为Monod常数， 是指比生长速率达到最大比生长速率二分之一时限制性基质浓度。第39页第39页限制性基质物料平衡式连续培养时方程改变形式第40页第40页7、酶生产过程中产酶动力学 第41页第41页与生长相关与生长部分相关与生长无关第42页第42页惯用几种模型第43页第43页五、酶生产菌种枯草杆菌：淀粉酶、蛋白酶；巨大芽孢杆菌：葡萄糖异构酶；大肠杆菌：谷氨酸脱羧酶、青霉素酰化酶等。啤酒酵母：转化酶、醇脱氢酶；假丝酵母：脂肪酶、转化酶；黑曲酶：果胶酶、酸性蛋白酶、糖化酶；根霉：糖化酶、转化酶；毛霉菌：蛋白酶、糖化酶、

19、脂肪酶；青霉：纤维素酶、葡萄糖氧化酶；米曲霉：糖化酶、蛋白酶；链霉菌：青霉素酰化酶、碱性蛋白酶、几丁质酶。 第44页第44页六、酶发酵生产工艺过程1、种子扩大培养目的：为每次发酵罐投料提供一定数量代谢旺盛菌种。 种子扩大培养级数分为多级流程（普通三级）：斜面菌种摇床一级种子培养-二级种子罐培养-发酵罐第45页第45页2、发酵办法（1）固体发酵法：第46页第46页（2）液体发酵法：第47页第47页（3）固定化细胞（4）固定化原生质体第48页第48页3、发酵工艺条件控制（液体发酵为例）（1）pH值调整细胞产酶最适pH通常靠近于该酶反应最适pH。如：碱性蛋白酶最适pH为pH8.5-9.0；中性蛋白酶

20、最适pH为pH6.0-7.0；酸性蛋白酶最适pH为pH4-6；不同细胞需不同pH值;同一细胞不同pH值条件下产物也不同.黑曲霉中性时产-淀粉酶多于产糖化酶，偏酸时产糖化酶提升而产淀粉酶降低。第49页第49页（2）温度调整：产酶速度：分段控温。产热原因：生物热+搅拌热-蒸发热-显热-辐射热控制：冷却（3）溶解氧调整N=KLC（C*-C）影响：菌体生长；代谢路径原因：菌体生长代谢；发酵异常（染菌：好氧杂菌、噬菌体；设备故障：加油器失灵、搅拌停止、温控失灵、空气管堵塞）控制：供氧角度（罐结构L/D、搅拌、气体成份、通气速率、罐压）；耗氧角度（基质浓度、温度、表面活性剂）。第50页第50页4、提升酶产

21、量办法（1）添加诱导物：酶作用底物、酶反应产物、酶底物类似物。（2）控制阻遏物浓度：流加难利用碳源；减少未端产物浓度。（3）添加表面活性剂：非离子表面活性剂（吐温等）可增长细胞通透性。（4）添加产酶增进剂：植酸钙镁霉菌蛋白酶；PVA糖化酶；醋酸钠纤维素酶第51页第51页1、激肽释放酶（1）药理功效-含有扩张血管功效，并能提升血管通透性，起到改进血液循环作用。（2）临床应用-治疗动脉硬化、血管炎、四肢皮肤溃疡。（3）生产办法 提取法生产-以猪颔下腺为原料进行提取。 提取法生产-以猪胰脏为原料进行提取。七、常见药用酶生产第52页第52页2、双链酶（1）药理作用-内含二种酶，两者合用可清除炎症物、脓块、瘀血，增进外伤伤愈合。 链激酶（SK）、又称为溶栓酶。能溶解血栓和渗出物纤维部分。链道酶（SD）、又称为脱氧核糖核酸酶。能够液化死细胞（2）临床应用-治疗血肿、脓肿、骨髓炎、创伤性感染、溃疡。（3）生产办法-细菌发酵法生产。第53页第53页3、超氧化物歧化酶（1）药理作用-能专一性地清除人体内超氧阴离子自由基。（2）临床应用-治疗类风湿关节炎，本身