蛋白质分离纯化与鉴定技术课件

1、蛋白质分离纯化与鉴定技术题记：上世纪七十年代，蛋白纯化一度受到冷落的现象将一去不复返了报告内容蛋白质分离纯化的常用技术手段分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策蛋白质的纯度及活性测定有关蛋白质纯化的整体思考应用举例蛋白质分离纯化的常用技术手段发酵液预处理细胞分离细胞破碎碎片分离产品粗纯胞内产物胞外产物加热、调PH、絮凝离心、膜分离珠磨法、高压匀浆、超声法、酶解法离心、双水相萃取、膜分离盐析、层析、膜分离产品精纯层析、膜分离成品制作浓缩、干燥、无菌过滤、成型常用纯化技术从上表可以总结出，蛋白分离纯化中的常用技术如下：絮凝、膜分离、细胞破碎、双水相萃取、盐析、柱层析、离心等。絮凝技术我国工业大规模发酵

2、一般仍采用粗料发酵（料液中含豆饼粉、玉米粉等），发酵液含大量残留培养基，造成固液分离困难。絮凝技术可较好地解决这一问题。絮凝技术：通过在发酵液中加入大分子物质（壳聚糖）和盐类，从而改变固体粒子的物理特性，使之聚合在一起形成更大的粒子而沉降，这一技术称为絮凝技术。名 称粒子大小分离原理粒子过滤10um筛分原理微滤0.0510um超滤1 1000kD受分子大小、分子构象、携带电荷等多种因素影响纳滤100 1000反渗透100的有机物透析小分子有机物和离子电渗析离子、氨基酸渗透蒸发100的有机物透析：它基于分子大小、分子构象与电荷、以浓度梯度为驱动力，通过水与小分子物质扩散达到分离浓缩的目的。截留分

3、子量的确定：选择截留率在90%那点对应的分子量作为该膜的截留分子量。由于各个厂家所用的标准品不同，所以很难把不同来源的膜的截留分子量作统一比较。珠磨破碎细胞法利用珠磨机内大量的玻璃珠在搅拌桨的作用下通过碰撞、剪切等作用撕破或磨碎细胞以达到胞内产物释放的方法。珠磨机物料的出口处设有夹缝或筛孔板用以截留玻璃珠，从而实现连续操作。物料入口物料出口优点：处理量大，与高压匀浆法比，更容易进行温度控制。缺点：样品有一定程度的损耗，破碎程度较难控制。高压匀浆破碎细胞法利用高压破碎细胞，其原理为：从高压室（几百个大气压）压出的细胞悬液经过阀坐的中心孔道从阀坐和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达每秒几百米。这种高

4、速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列的过程中经历了高速造成的剪切、碰撞、以及由高压到常压的变化，从而造成细胞的破碎。双水相萃取萃取：利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差异进行分离的技术。有机溶剂萃取：有机溶剂从水中萃取物质。反萃取：水溶液从有机溶剂中萃取物质。以上萃取的共同点是：萃取反应中的两相性质差异显著，表面张力大，易导致物质失活。双水相萃取：因两种水溶性聚合物的水溶液或一种水溶性聚合物的水溶液与盐液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。优点：萃取条件温和两相均含有大量水（80%以上）界面张力小；生物相容性好，有时还有稳定作用；分配系数可控（相

5、系统组成、聚合物修饰）；易于放大（几百上千倍）。缺点：系统中较高浓度的水溶性聚合物和盐会带到产物中，去除需要辅助方法。应用举例聚乙二醇/葡聚糖系统：9% PEG 4000 / 1.25% DEX 1500, PH 7.8聚乙二醇/盐系统：聚乙二醇/磷酸钾、磷酸钠、硫酸铵、硫酸钠、琥铂酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠。真核细胞表达的beta-IFN经双水相萃取，提纯了630倍。可能的应用超声上清PEG/盐系统疏水层析盐析常用的为硫酸铵沉淀，实际上很多种盐对蛋白均有沉淀作用，如硫酸钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。上述盐类对蛋白的沉淀能力，对系统PH值的影响均有不同，可根据实际情况进行选择。色谱层析正

6、相色谱反相色谱色谱柱基本理论VR1VR2W1W2W1+W22(VR2VR1 )RS=RS1.5时两个组分才能完全分开塔板数的计算n=5.54(VR/Wh/2)2VRWh/2VR：峰高 Wh/2 ：1/2峰高处的峰宽 由公式可知，峰越尖， n值越大，柱子的分离能力越强为便于比较，一般要给出每米柱子的理论塔板数N，我们可以由N值推算出层析柱的理论塔板高度： H=1000mm/N通过进一步的数学推导，可以得到以下公式： H=2.48dpi其中dpi代表分离介质微粒的直径，由此可看出，分离填料的颗粒越细，则每米理论塔板数越高，从而每米柱长的分辨率也越高虽然分离介质的颗粒越小，分辨率越高，但同时也造成柱

7、子的反压增大，流速降低，同时生产成本大幅增高。根据目前的研究情况预测，填料直径的最小极限是3um左右。层析柱的分类按流动相与固定相的极性分：正相、反相按样品在固定相与流动相之间的分配情况分：线性、非线性按分离效率分，HPLC、常规柱色谱固定相样品浓度流动相样品浓度线性色谱非线性色谱线性和非线性色谱线性色谱1：样品的保留值不变2：峰形对称3：色谱峰的峰高与浓度呈线性关系非线性色谱1：样品的保留值可变2：峰形不对称3：色谱峰的峰高与浓度不呈线性关系HPLC和常规柱色谱HPLC高效体积排阻层析高效离子交换层析高效疏水层析高效反相层析高效亲和层析常规柱色谱体积排阻层析离子交换层析疏水层析亲和层析HPL

8、C优点：分离效率高分离速度快可重复性强缺点：设备昂贵填料昂贵填料耐受酸碱的能力差与软胶相比，生物相容性差常规柱色谱优点：生物相容性好，尤其适合分离生物大分子易于装填、易于放大其配套设备，分离介质及在使用方面的理论和经验均较成熟。成本低廉缺点：柱效低，目前应用的最小颗粒为10um分离速度慢，只能承受很小的压力分离介质为软胶，在不同的PH及盐浓度下，有溶胀或收缩的现象发生，影响分离效果体积排阻层析分离原理：根据分子的流体力学半径大小进行分离。影响因素：分离介质（疏水性、荷电情况）；样品性质（疏水性、荷电情况）；缓冲液组成（表面活性剂、粘度）体积排阻层析介质的选择分子量分离范围3000-70000S

9、epharoseSephadexSuperdex颗粒大小凝胶类型SELECTION GUIDE BY TECHNICAL OVERVIEW - Gel FiltrationUsefulUsefulRec. Flow Rate*Fractionation Range (Mr)Fractionation Range (Mr)Prepacked ColumnsAverage ParticleProduct(Proteins)(Dextrans)(ml/min)Size (m)SuperdexPrepacked HR, PC and PE columnsSuperdex PeptideENDREF10

10、0-7 000 (peptides)NA0.4-1.2 *13Superdex 75ENDREF3 1037 1045 102 - 3 1040.4-1.0 *13Superdex 200ENDREF1 104 - 6 1051 103 - 1 1050.4-1.0 *13Superdex prep gradeHiLoad prepacked columns and lab packsSuperdex 30 prep gradeENDREFup to 1 104NA0.3-1.734Superdex 75 prep gradeENDREF3 103 - 7 1045 102 - 3 1040.

11、3-1.734Superdex 200 prep gradeENDREF1 104 - 6 1051 103 - 1 1050.3-1.734SuperosePrepacked HR and PC columnsSuperose 12ENDREF1 103 - 3 105NA0.1-0.510Superose 6ENDREF5 103 - 5 106NA0.1-0.513Superose prep gradeLab packsSuperose 12 prep gradeENDREF1 103 - 3 105up to 3 1050.5 *30Superose 6 prep gradeENDRE

12、F5 103 - 5 106up to 1 1060.3-0.5 *30SephacrylHiPrep prepacked columns and lab packsSephacryl S-100 HRENDREF1 103 - 1 105NA0.1-1.050Sephacryl S-200 HRENDREF5 103 - 2.5 1051 103 - 8 1040.1-1.050Sephacryl S-300 HRENDREF1 104 - 1.5 1062 103 - 4 1050.1-1.050Sephacryl S-400 HRENDREF2 104 - 8 1061 104 - 2

13、106NA50Sephacryl S-500 HRENDREFNA4 104 - 2 107NA50Sephacryl S-1000 SFENDREFNA5 105 - 108NA50UsefulUsefulApprox. Max.Fractionation Range (Mr)Fractionation Range (Mr)Bed VolumeFlow RateParticle Size Range,Product(Globular proteins)(Dextrans)ml/g Dry Sephadex(ml/min)*Wet Bead (m)SephadexSephadex G-10EN

14、DREFup to 7 102up to 7 1022-3 Darcys law*55-165Sephadex G-15ENDREFup to 1.5 103up to 1.5 1032.5-3.560-180Sephadex G-25 FineENDREF1 103 - 5 1031 102 - 5 1034-6Darcys law35-140 Medium85-260 Coarse170-520 Superfine17-70Sephadex G-50 FineENDREF1.5 103 - 3 1045 102 - 1 1049-11Darcys law40-160 Medium100-3

15、00 Coarse200-610 Superfine20-80Sephadex G-75ENDREF3 103 - 8 1041 103 - 5 10412-156.490-280 Superfine3 103 - 7 104NANA1.525-90Sephadex LH-20ENDREF 5 103NAdepends on solventNA NA* Distilled water, 25 C. 离子交换层析在适宜的载体上，例如纤维素、琼脂糖凝胶、交联的葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶以及各种合成高聚物型凝胶上，通过酯化、醚化或氧化等化学反应，引入具有酸性或碱性的离子基团，便可制备出各种类型的离子

16、交换填料。离子交换层析的分类离子交换填料的选择离子交换类型DEAEQSP凝胶类型颗粒大小CM200-600100-30040-16020-8010-20琼脂糖含量及交联度Sepharose 6B、4B、2BSepharose CL-6B、CL-4B、CL-2BSepharose F.F高交联度，刚性更强。随着交联度的提高，疏水性随之增强，更易发生非特异吸附，故交联度不能过分提高疏水层析疏水介质的选择配基类型高密普通凝胶类型颗粒大小影响疏水层析的因素温度盐的类型及浓度PH盐对疏水作用的影响PH对疏水作用的影响亲和层析亲和层析金属螯合层析优点:对基质要求低特异性强新型色谱简介贯流色谱、整体柱色谱、

17、扩张床色谱贯流色谱贯流色谱所用的填料，既有通常的微孔或大孔（50-150nm），又有贯串整个颗粒的600-800nm的超大孔存在。这种贯串的大孔，可允许流动相直接进入填料颗粒内部并贯串而过，即以贯串孔将填料分割成更细小的颗粒，相当于极大地降低了填料颗粒的直径，从而使柱子具有更高的分辨率及承受更高的流速。整体柱色谱整体柱，又称为连续固定相，是用原位聚合和类似浇铸的方法，在色谱柱空管内或不用柱管所形成的整体连续的柱体，而不需要用细粒径的填料去装填。这种柱子可承受很高的流速，同时具有很高的分辨率。扩张床色谱层析柱用于纯化的一般原则离子交换层析疏水作用层析金属螯合层析羟基磷灰石层析亲合层析凝胶过滤层析

18、HPLC共价键层析设计纯化方案的一般原则同一分离原理的技术不能重复使用在同等效率下，尽量使用简单易行之方法尽量避免两个操作单元之间进行物料的辅助处理，充分利用单元操作间的互补性，提高工作效率最短时间，获最好效果有较高的可变动工艺范围，能适应上游工艺的波动工艺稳定，不因操作人员和时空变化而变动容易放大分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策蛋白质失活的机制一级结构被破坏，导致三维结构的变化，造成失活。主要表现为：肽键的酸水解和酶水解；Cys、Trp、Met的氧化；二硫键被还原，伴随-消失和-SH形成；巯基与金属离子作用，形成巯醇盐；Asn和Gln的脱酰胺作用；氨基酸的消旋作用；Pro的异构化蛋白质三级

19、或四级结构的变化也可能导致失活，主要机制有：聚集（有时伴随分子和分子间二硫键的形成）；酶失去辅酶；寡聚蛋白质解离成单体；吸附于容器表面；不正确的折叠形式或形成错配的二硫键。影响蛋白质稳定性的因素蛋白质越纯越不稳定蛋白质结构中影响稳定性的重要因素疏水相互作用对维持蛋白质的天然结构起重要乃至决定性的作用，一般而言，疏水性越强的蛋白质，其热稳定性往往越高蛋白质内二硫键数量的增加将提高蛋白质的稳定性氢键和离子键以及一些金属离子对蛋白质的稳定性也有很重要的作用外界因素对稳定性的影响缓冲液的组成影响蛋白的稳定性温度、反复冻溶、PH对蛋白稳定性的影响机械剪切力及泡沫化对蛋白稳定性的影响器壁吸附对蛋白稳定性的

20、影响。蛋白质的器壁吸附吸附现象是其分离纯化及保存过程中经常遇到的问题，稀蛋白溶液更易发生吸附，最大量的吸附往往发生在等电点附近。疏水表面往往较亲水表面吸附更多的蛋白质。吸附过程中蛋白质结构会发生重排，即会有变性现象发生，这种变性分可逆不可逆两种，大多数蛋白与聚苯乙烯的吸附即是不可逆的蛋白酶及微生物的影响稳定蛋白质的手段添加蛋白质稳定剂共溶剂：糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物如聚乙二醇等，它们通过改变溶液的热力学性质使蛋白质的稳定性得到增强蛋白质，血清白蛋白是一种常用的保护剂，但由于它能与一些分子结合，使用时也需谨慎抗氧化保护剂：包括还原剂、金属螯合剂及其它一些试剂底物、辅酶

21、和活化离子磷脂和脂肪酸蛋白酶抑制剂优化操作条件提供温和的操作条件，合适的温度、合适的PH、避免使用有机溶剂及变性剂、脱气处理（蛋白质对剪切力并不是十分敏感，但当空气存在时在气-液接触面剪切力将具有变性效应）避免氧化失活，加入保护剂、防止阳光直射及脱气避免蛋白酶水解和微生物污染减少纯化步骤，进行纯化过程的集成蛋白质的纯度及活性测定蛋白质纯度的测定蛋白质纯度可根据它本身所具有的分子特性来判定，通常采用的方法为SDS(非还原)、HPLC、毛细管电泳(CE)、等电聚焦、肽谱分析、氨基酸序列分析和组成分析等。蛋白质纯度要用一种以上的方法来判定，最常用的组合为SDS和HPLC。SDS及染色方法还原SDS，用于分子量的测定非还原SDS（不含DTT或beta-巯基乙醇），用于蛋白纯度测定。要求上样量大于5微克染色方法：过去强调银染，但该方法对某些蛋白不敏感，如IL-2即被负染。故目前仍广泛采用考马斯亮兰染色，但要求加样量大于5微克SDS结果判定EPO由于在纯化过程中糖基化有丢失，所以电泳结果不呈一锐利条带，而呈弥散状，但考虑到其糖基化丢失情况，仍判定合格。GM-CSF电泳出现三条带，但由于一些酶可使其N端发生降解，从而产生三条带，鉴于三条带均有生物活性，而且又能通过WB证明