益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节激酶激活的影

1、益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节激酶激活的影【摘要】目的观察益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞(glerularesangialell,G)增殖及细胞外信号调节激酶(extraellularsignal-regulatedkinases,ERK)磷酸化的抑制作用。方法将含低、中、高剂量益肾蠲湿合剂的药物血清作用于10%血清-DE培养液培养的G,分别用TT和esternBlt方法检测细胞增殖和磷酸化ERK1/2的表达。结果益肾蠲湿合剂对G增殖有明显的抑制作用，并随着剂量的增加作用也逐渐增强。细胞总ERK在各组间无明显差异。但不同浓度的益肾蠲湿合剂均显著地抑制血清所诱导的ERK1/2的磷

2、酸化。结论益肾蠲湿合剂可通过抑制ERK1/2的磷酸化抑制G的增殖。【关键词】益肾蠲湿合剂；肾小球系膜细胞；增殖；细胞外信号调节激酶Abstrat：bjetiveTbservetheeffetf“Yishenjuanshintheprliferatinfglerularesangialells(Gs)andthephsphrylatinfextraellularsignal-regulatedkinases(ERK).ethdsAllherbsin“Yishenjuanshiixtureerebiledinaterandnentratedtdifferentdses.After7daysf“Yi

3、shenjuanshitreatent,serufrratseyebldaslleted.Gsereulturedinserufreeediufr48hsandthen10%FS-DEithrithutseruinluding“YishenjuanshitdetetGsprliferatinandexpressinfphsphrylatedERK(p-ERK)byTTandesternBltrespetively.ResultsL,ediuandhighdsefYishenjuanshitreatentsignifiantlyinhibitedGprliferatinhenGsereultur

4、edfr24,48and72h;andtheinhibitinratisinreasedasthedseinreased.ThereasndiffereneinttalERKexpressin.Hever,“Yishenjuanshitreatentsithdifferentdseallarkedlyinhibitedp-ERKexpressinstiulatedbyFS.nlusin“YishenjuanshitreatentinhibitsGprliferatinviablkingERKphsphrylatin.Keyrds：“Yishenjuanshiixture;Glerularesa

5、ngialell;Prliferatin;ERK复方益肾蠲湿合剂是华北煤炭医学院张健教授在多年临床和实验研究的根底上，拟定的治疗各型慢性肾炎的根本方药。本方直接针对慢性肾炎根本发病机理，重用黄芪，辅以枸杞、猪苓等药物，起到补气，滋肾阴、清热、解毒等作用。既往研究说明益肾蠲湿合剂在治疗临床狼疮性肾炎及实验性家兔系膜增生性肾炎获得了良好的效果1，2，不但明显缓解了慢性肾炎的临床病症，还全面改善了肾功能，从而延缓肾小球硬化和慢性肾炎的进展。导致慢性肾炎和肾小球硬化的重要原因之一是肾小球系膜细胞(glerularesangialell,G)的过度增殖3，为此本研究将观察益肾蠲湿合剂对G增殖的抑制作用，

6、并进一步讨论其作用机理，从细胞和分子生物学方面讨论其防治肾小球硬化的作用机制。1材料与仪器1.1益肾蠲湿合剂水煎液由华北煤炭医学院中西医结合医院提供。1.3仪器及试剂超净工作台(美国Frasientifipany)；倒置显微镜(日本Nikn公司)；2恒温培养箱(美国Frasientifipany)；四甲基偶氮唑盐(TT，Siga公司产品)；抗体p-ERK1/2和t-ERK1/2美国ellSignaling。2方法2.1含药血清的制备4将大鼠随机分为4组，即对照组，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂组。对照组给予等体积的生理盐水，益肾蠲湿合剂以临床成人日用量的10倍作为中剂量，20倍和5倍分别作为高剂

7、量和低剂量。灌胃给药连续7d，第7天重复给药两次，间隔时间2h，并于末次给药后1h后，眼球取血，无菌条件下别离血清，置56水浴30in灭活抗体，再经0.2滤膜过滤除菌，-20保存。2.2细胞增殖的测定检测采用四唑盐(TT)比色法。G传代后，制成密度为1.5104/l的细胞悬液，参加96孔板内每孔200l，置37，5%2培养箱中孵育24h，吸弃上清液，参加无血清培养液200l。继续培养48h，使绝大局部细胞处于同步G0期。弃上清液，分别参加DE培养液160l、血清20l及低、中、高剂量的含药血清20l，每组设5个复孔，分别于培养24，48和72h时取出培养板参加TT20ul(5g/1)，继续培养

8、4h，吸弃各孔培养液，参加100lDS，室温避光，轻轻振荡10in，使结晶充分溶解后，酶标仪490n波长处读取D值。2.3磷酸化ERK1/2p-ERK12表达的检测G经上诉方法同步化后，分别参加DE培养液160l、血清20l及低、中、高剂量的含药血清20l，每组设2个复孔，培养2h。用预冷的PBS洗涤3次，参加细胞裂解液(50l/LTrispH8.0，150l/LNa1，1%NP-40，0.1SDS，0.5%D，2l/LEDTA，1l/LPSF，10l/Lleupeptin，1l/LpepstatinA，1g/lLaprtinin)裂解细胞，冰浴30in后,410000r/in离心10in，搜

9、集上清。考马斯亮蓝染色检测总蛋白浓度后，取135g总蛋白按常规方法进展8SDS电泳并转膜，根据arker定位保存含目的条带区域的硝酸纤维素膜并用质量分数5%脱脂奶粉室温下封闭1h，参加封闭液稀释的抗p-ERK1/2或t-ERK1/2的抗，4过夜。次日漂洗3次后，参加稀释后的抗，室温反1h。漂洗3次，参加DAB显色。p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白大小约为42，44KDa。图片分析仪扫描后，Quantityne软件分析。2.4统计学处理用SAS软件进展统计处理。所有数值以均数标准差表示，两样本间均数的比拟采用t检验。P0.05为差异显著，用a表示；P0.01为差异极显著，用b表示。转贴于论

10、文联盟.ll.3结果3.1益肾蠲湿合剂对G增殖的影响由表1看出，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂不同程度地抑制了血清诱导的G的增殖，其中以高剂量的益肾蠲湿合剂的抑制作用最为明显，抑制率在24,48和72h分别为31.7%，39.3%和47.5%；中剂量组也显著地抑制了G的增殖，抑制率分别为25.9%，32.2%和40.5%；低剂量组也有效地抑制G的增殖，抑制率分别为13.3%，19.3%和28.3%。与对照组相比，各组在各时间点的抑制率均有统计学意义。另外，益肾蠲湿合剂的抑制作用随着作用时间的延长或剂量的增大而明显增强，存在一定的时效及量效关系。3.2益肾蠲湿合剂对GERK1/2磷酸化的影响各组T

11、tal-ERK1(t-ERK1)和Ttal-ERK2(t-ERK2)的表达没有明显区别。血清所诱导GERK1/2的磷酸化p-ERK1/2可明显被“益肾蠲湿合剂所抑制，并且随着剂量的增加抑制作用也增强。在对p-ERK1的抑制中，低、中和高剂量组的抑制率分别为52.3%，69.8%和74.6%；对p-ERK2的抑制率分别为48.0%，68.8%和72.8%,具有一定的量效关系。与正常对照组相比，各组均有统计学意义。结果见图1及表2。表1不同剂量的益肾蠲湿合剂对血清诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响略表2不同剂量的益肾蠲湿合剂对血清诱导的p-ERK1/2表达的影响略4讨论肾小球系膜细胞(G)存在于肾

12、小球毛细血管之间，具有合成分泌系膜基质，吞噬沉积的免疫复合物的作用。正常时G不发生明显的增殖，但在慢性炎症等病理情况下那么出现异常的增生，过度增殖的G及其分泌的基质一方面突入肾小球毛细血管壁，导致管壁增厚、管腔狭窄，另一方面积聚在肾小球内,导致肾小球硬化，造成肾脏功能进展性损害3，4。因此，有效地抑制G的增殖将会在很大程度上减缓肾小球硬化及慢性肾炎的进展。自拟中药复方益肾蠲湿合剂以黄芪为君，辅以枸杞、猪苓等药物，起到补气、滋肾阴、清热、解毒等作用。既往研究说明其在临床治疗狼疮性肾炎及实验性家兔系膜增生性肾炎中均获得了良好的效果1，2，临床上，不但明显缓解了临床病症还全面改善了肾功能。本研究利用

13、体外培养的G，观察含不同浓度益肾蠲湿合剂的药物血清对G增殖的抑制作用，结果证实该中药复方有效地抑制了G的增殖，并且最高抑制率达47.5%。孙晋芳等5人曾报道黄芪的重要成分黄芪皂苷可将G阻滞在G0/G1期，从而抑制细胞的增殖。本复方重用黄芪，推测可能与这一作用有关。细胞外信号调节激酶(extraellularsignal-regulatedkinases,)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，被磷酸化后激活，是传递丝裂原信号的重要传导蛋白，负责将信号从外表受体传导至细胞核内，促进细胞增殖。ERK包括五个亚族(ERKl-ERK5)，其中以ERKl和ERK2分布最为广泛，研究最多。Bassa等6报道脂多糖通过

14、诱导ERK1/2的磷酸化p-ERK1和p-ERK2促进人G的增殖。elsh等7也报道激活的ERK通过增加细胞周期蛋白D1ylinD1推动细胞进入细胞分裂周期。为进一步讨论本复方抑制G增殖的机理，我们观察了磷酸化的ERK1/2的表达情况。结果显示T-ERK1/2的表达在各组之间没有明显区别，但各剂量组均能明显地抑制血清诱导的ERK1/2的磷酸化，其中对ERK1的最高抑制率达74.6%，对ERK2的最高抑制率达72.8%。说明益肾蠲湿合剂可以通过抑制ERK1/2的磷酸化来抑制G的增殖，从而延缓肾小球的硬化和慢性肾炎的进展。但其是否还可以抑制G分泌系膜基质还有待于进一步研究。【参考文献】1孙影，刘阳

15、，杨方，等.益肾蠲湿合剂治疗狼疮性肾炎疗效观察J.辽宁中医杂志,2022,9:1368.2张健，张数峰，杨金生，等.益肾蠲湿合剂治疗实验性家兔系膜增生性肾炎的研究J.华北煤炭医学院学报,2022,8(3):292.3Diez-arquesL，rtega-VelazquezR，Langa,eta1Expressinfendglininhuanesangialells:dulatinfextraelularatrixsynthesisJBihiBiphysAta,22,1587(1):36.4钟丹，杨霓芝，赵代鑫，等.中药复方通脉口服液对肾小球系膜细胞增殖及分泌IL-1的影响J.时珍国医国药,2022,19(1):4.5孙晋芳，焦金菊，宋其蔓，等.黄芪皂甙对大鼠肾小球系膜细胞增殖及周期的影响J.中国组织工程研究与临床康复,2022,12(15):2926.6BassaBV,NhJ,GanjiSH,etal.LysphsphatidylhlinestiulatesEGFreeptr