LabAlliace高效液相色谱系统培训教材(增加)

1、天津兰博实验仪器设备有限公司LabAAlliiacee高效液液相色谱谱系统培培训教材材一、液相相色谱系系统的基基本原理理 1、色谱法法分类按两相的的物理状状态可分分为：气气相色谱谱法(GGC)和和液相色色谱法(LC)。气相相色谱法法适用于于分离挥挥发性化化合物。GC根根据固定定相不同同又可分分为气固固色谱法法(GSSC)和和气液色色谱法(GLCC)，其其中以GGLC应应用最广广。液相相色谱法法适用于于分离低低挥发性性或非挥挥发性、热稳定定性差的的物质。LC同同样可分分为液固固色谱法法(LSSC)和和液液色色谱法(LLCC)。此此外还有有超临界界流体色色谱法(SFCC)，它它以超临临界流体体（界

2、于于气体和和液体之之间的一一种物相相）为流流动相（常常用COO2），因因其扩散散系数大大，能很很快达到到平衡，故故分析时时间短，特特别适用用于手性性化合物物的拆分分。按原理分分为吸附附色谱法法(ACC)、分分配色谱谱法(DDC)、离子交交换色谱谱法(IIEC)、排阻阻色谱法法(ECC，又称称分子筛筛、凝胶胶过滤(GFCC)、凝凝胶渗透透色谱法法(GPPC）和和亲和色色谱法。(此外外还有电电泳)。按操作形形式可分分为纸色色谱法(PC)、薄层层色谱法法(TLLC)、柱色谱谱法。2、液相相色谱理理论发展展简况色谱法的的分离原原理是：溶于流流动相(mobbilee phhasee)中的的各组分分经过固

3、固定相时时，由于于与固定定相(sstattionnaryy phhasee)发生生作用（吸吸附、分分配、离离子吸引引、排阻阻、亲和和）的大大小、强强弱不同同，在固固定相中中滞留时时间不同同，从而而先后从从固定相相中流出出。又称称为色层层法、层层析法。色谱法最最早是由由俄国植植物学家家茨维特特（Tsswettt）在在19006年研研究用碳碳酸钙分分离植物物色素时时发现的的，色谱谱法(CChroomattogrraphhy)因因之得名名。后来来在此基基础上发发展出纸纸色谱法法、薄层层色谱法法、气相相色谱法法、液相相色谱法法。液相色谱谱法开始始阶段是是用大直直径的玻玻璃管柱柱在室温温和常压压下用液液

4、位差输输送流动动相，称称为经典典液相色色谱法，此此方法柱柱效低、时间长长（常有有几个小小时）。高效液液相色谱谱法(HHighh peerfoormaancee Liiquiid CChroomattogrraphhy，HHPLCC)是在在经典液液相色谱谱法的基基础上，于于60年年代后期期引入了了气相色色谱理论论而迅速速发展起起来的。它与经经典液相相色谱法法的区别别是填料料颗粒小小而均匀匀，小颗颗粒具有有高柱效效，但会会引起高高阻力，需需用高压压输送流流动相，故故又称高高压液相相色谱法法(Hiigh Preessuure Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HPPLC)。又

5、因因分析速速度快而而称为高高速液相相色谱法法(Hiigh Speeed Liqquidd Chhrommatoograaphyy，HSSLP)。也称称现代液液相色谱谱。3、HPPLC的的特点和和优点HPLCC有以下下特点：高压压压力可达达15003000kg/ccm2。色谱谱柱每米米降压为为75 kg/ccm2以上。高速流流速为00.1100.00 mll/miin。高效可可达50000塔塔板每米米。在一一根柱中中同时分分离成份份可达1100种种。高灵敏度度紫外外检测器器灵敏度度可达00.011ng。同时消消耗样品品少。HPLCC与经典典液相色色谱相比比有以下下优点：速度快通常分分析一个个样品

6、在在1530 minn，有些些样品甚甚至在55 miin内即即可完成成。分辨率高高可选选择固定定相和流流动相以以达到最最佳分离离效果。灵敏度高高紫外外检测器器可达00.011ng，荧荧光和电电化学检检测器可可达0.1pgg。柱子可反反复使用用用一一根色谱谱柱可分分离不同同的化合合物。样品量少少，容易易回收样品经经过色谱谱柱后不不被破坏坏，可以以收集单单一组分分或做制制备。4、高效效液相色色谱分离离原理高效液相相色谱法法按分离离机制的的不同分分为液固固吸附色色谱法、液液分分配色谱谱法（正正相与反反相）、离子交交换色谱谱法、离离子对色色谱法及及分子排排阻色谱谱法。a液固固色谱法法使用用固体吸吸附剂

7、，被被分离组组分在色色谱柱上上分离原原理是根根据固定定相对组组分吸附附力大小小不同而而分离。分离过过程是一一个吸附附解吸吸附的平平衡过程程。常用用的吸附附剂为硅硅胶或氧氧化铝，粒粒度510m。适适用于分分离分子子量2000110000的组分分，大多多数用于于非离子子型化合合物，离离子型化化合物易易产生拖拖尾。常常用于分分离同分分异构体体。b液液液色谱法法使用用将特定定的液态态物质涂涂于担体体表面，或或化学键键合于担担体表面面而形成成的固定定相，分分离原理理是根据据被分离离的组分分在流动动相和固固定相中中溶解度度不同而而分离。分离过过程是一一个分配配平衡过过程。涂布式固固定相应应具有良良好的惰惰

8、性；流流动相必必须预先先用固定定相饱和和，以减减少固定定相从担担体表面面流失；温度的的变化和和不同批批号流动动相的区区别常引引起柱子子的变化化；另外外在流动动相中存存在的固固定相也也使样品品的分离离和收集集复杂化化。由于于涂布式式固定相相很难避避免固定定液流失失，现在在已很少少采用。现在多多采用的的是化学学键合固固定相，如如C188、C8、氨基基柱、氰氰基柱和和苯基柱柱。液液色谱谱法按固固定相和和流动相相的极性性不同可可分为正正相色谱谱法(NNPC)和反相相色谱法法(RPPC)。正相色谱谱法采采用极性性固定相相(如聚聚乙二醇醇、氨基基与腈基基键合相相)；流流动相为为相对非非极性的的疏水性性溶剂

9、(烷烃类类如正已已烷、环环已烷），常常加入乙乙醇、异异丙醇、四氢呋呋喃、三三氯甲烷烷等以调调节组分分的保留留时间。常用于于分离中中等极性性和极性性较强的的化合物物(如酚酚类、胺胺类、羰羰基类及及氨基酸酸类等）。反相色谱谱法一一般用非非极性固固定相（如如C188、C8）；流流动相为为水或缓缓冲液，常常加入甲甲醇、乙乙腈、异异丙醇、丙酮、四氢呋呋喃等与与水互溶溶的有机机溶剂以以调节保保留时间间。适用用于分离离非极性性和极性性较弱的的化合物物。RPPC在现现代液相相色谱中中应用最最为广泛泛，据统统计，它它占整个个HPLLC应用用的800%左右右。随着柱填填料的快快速发展展，反相相色谱法法的应用用范围

10、逐逐渐扩大大，现已已应用于于某些无无机样品品或易解解离样品品的分析析。为控控制样品品在分析析过程的的解离，常常用缓冲冲液控制制流动相相的pHH值。但但需要注注意的是是，C118和CC8使用的的pH值值通常为为2.557.5（228），太太高的ppH值会会使硅胶胶溶解，太太低的ppH值会会使键合合的烷基基脱落。有报告告新商品品柱可在在pH 1.55100范围操操作。正相色谱谱法与反反相色谱谱法比较较表正相色谱谱法 反反相色谱谱法固定相极极性高中 中低低流动相极极性低中 中高高组分洗脱脱次序极极性小先先洗出 极性性大先洗洗出从上表可可看出，当当极性为为中等时时正相色色谱法与与反相色色谱法没没有明显

11、显的界线线（如氨氨基键合合固定相相）。c离子子交换色色谱法固定相相是离子子交换树树脂，常常用苯乙乙烯与二二乙烯交交联形成成的聚合合物骨架架，在表表面未端端芳环上上接上羧羧基、磺磺酸基（称称阳离子子交换树树脂）或或季氨基基（阴离离子交换换树脂）。被分离离组分在在色谱柱柱上分离离原理是是树脂上上可电离离离子与与流动相相中具有有相同电电荷的离离子及被被测组分分的离子子进行可可逆交换换，根据据各离子子与离子子交换基基团具有有不同的的电荷吸吸引力而而分离。缓冲液常常用作离离子交换换色谱的的流动相相。被分分离组分分在离子子交换柱柱中的保保留时间间除跟组组分离子子与树脂脂上的离离子交换换基团作作用强弱弱有关

12、外外，它还还受流动动相的ppH值和和离子强强度影响响。pHH值可改改变化合合物的解解离程度度，进而而影响其其与固定定相的作作用。流流动相的的盐浓度度大，则则离子强强度高，不不利于样样品的解解离，导导致样品品较快流流出。离子交换换色谱法法主要用用于分析析有机酸酸、氨基基酸、多多肽及核核酸。d离子子对色谱谱法又又称偶离离子色谱谱法，是是液液色色谱法的的分支。它是根根据被测测组分离离子与离离子对试试剂离子子形成中中性的离离子对化化合物后后，在非非极性固固定相中中溶解度度增大，从从而使其其分离效效果改善善。主要要用于分分析离子子强度大大的酸碱碱物质。分析碱性性物质常常用的离离子对试试剂为烷烷基磺酸酸盐

13、，如如戊烷磺磺酸钠、辛烷磺磺酸钠等等。另外外高氯酸酸、三氟氟乙酸也也可与多多种碱性性样品形形成很强强的离子子对。分析酸性性物质常常用四丁丁基季铵铵盐，如如四丁基基溴化铵铵、四丁丁基铵磷磷酸盐。离子对色色谱法常常用ODDS柱（即即C188），流流动相为为甲醇-水或乙乙腈-水水，水中中加入33100 mool/LL的离子子对试剂剂，在一一定的ppH值范范围内进进行分离离。被测测组分保保时间与与离子对对性质、浓度、流动相相组成及及其pHH值、离离子强度度有关。e排阻阻色谱法法固定定相是有有一定孔孔径的多多孔性填填料，流流动相是是可以溶溶解样品品的溶剂剂。小分分子量的的化合物物可以进进入孔中中，滞留留

14、时间长长；大分分子量的的化合物物不能进进入孔中中，直接接随流动动相流出出。它利利用分子子筛对分分子量大大小不同同的各组组分排阻阻能力的的差异而而完成分分离。常常用于分分离高分分子化合合物，如如组织提提取物、多肽、蛋白质质、核酸酸等。5、固定定相和流流动相在色谱分分析中，如如何选择择最佳的的色谱条条件以实实现最理理想分离离，是色色谱工作作者的重重要工作作，也是是用计算算机实现现HPLLC分析析方法建建立和优优化的任任务之一一。本节节着重讨讨论填料料基质、化学键键合固定定相和流流动相的的性质及及其选择择。（1）基基质（担担体）HPLCC填料可可以是陶陶瓷性质质的无机机物基质质，也可可以是有有机聚合

15、合物基质质。无机机物基质质主要是是硅胶和和氧化铝铝。无机机物基质质刚性大大，在溶溶剂中不不容易膨膨胀。有有机聚合合物基质质主要有有交联苯苯乙烯-二乙烯烯苯、聚聚甲基丙丙烯酸酯酯。有机机聚合物物基质刚刚性小、易压缩缩，溶剂剂或溶质质容易渗渗入有机机基质中中，导致致填料颗颗粒膨胀胀，结果果减少传传质，最最终使柱柱效降低低。A基质的的种类1）硅胶胶硅胶是HHPLCC填料中中最普遍遍的基质质。除具具有高强强度外，还还提供一一个表面面，可以以通过成成熟的硅硅烷化技技术键合合上各种种配基，制制成反相相、离子子交换、疏水作作用、亲亲水作用用或分子子排阻色色谱用填填料。硅硅胶基质质填料适适用于广广泛的极极性和

16、非非极性溶溶剂。缺缺点是在在碱性水水溶性流流动相中中不稳定定。通常常，硅胶胶基质的的填料推推荐的常常规分析析pH范范围为228。硅胶的主主要性能能参数有有：平均粒粒度及其其分布。平均孔孔径及其其分布。与比表表面积成成反比。比表面面积。在在液固吸吸附色谱谱法中，硅硅胶的比比表面积积越大，溶溶质的kk值越大大。含碳量量及表面面覆盖度度（率）。在反相相色谱法法中，含含碳量越越大，溶溶质的kk值越大大。含水量量及表面面活性。在液固固吸附色色谱法中中，硅胶胶的含水水量越小小，其表表面硅醇醇基的活活性越强强，对溶溶质的吸吸附作用用越大。端基封封尾。在在反相色色谱法中中，主要要影响碱碱性化合合物的峰峰形。几

17、何形形状。硅硅胶可分分为无定定形全多多孔硅胶胶和球形形全多孔孔硅胶，前前者价格格较便宜宜，缺点点是涡流流扩散项项及柱渗渗透性差差；后者者无此缺缺点。硅胶纯纯度。对对称柱填填料使用用高纯度度硅胶，柱柱效高，寿寿命长，碱碱性成份份不拖尾尾。2）氧化化铝具有与硅硅胶相同同的良好好物理性性质，也也能耐较较大的ppH范围围。它也也是刚性性的，不不会在溶溶剂中收收缩或膨膨胀。但但与硅胶胶不同的的是，氧氧化铝键键合相在在水性流流动相中中不稳定定。不过过现在已已经出现现了在水水相中稳稳定的氧氧化铝键键合相，并并显示出出优秀的的pH稳稳定性。3）聚合合物以高交联联度的苯苯乙烯-二乙烯烯苯或聚聚甲基丙丙烯酸酯酯为

18、基质质的填料料是用于于普通压压力下的的HPLLC，它它们的压压力限度度比无机机填料低低。苯乙乙烯-二二乙烯苯苯基质疏疏水性强强。使用用任何流流动相，在在整个ppH范围围内稳定定，可以以用NaaOH或或强碱来来清洗色色谱柱。甲基丙丙烯酸酯酯基质本本质上比比苯乙烯烯-二乙乙烯苯疏疏水性更更强，但但它可以以通过适适当的功功能基修修饰变成成亲水性性的。这这种基质质不如苯苯乙烯-二乙烯烯苯那样样耐酸碱碱，但也也可以承承受在ppH133下反复复冲洗。所有聚合合物基质质在流动动相发生生变化时时都会出出现膨胀胀或收缩缩。用于于HPLLC的高高交联度度聚合物物填料，其其膨胀和和收缩要要有限制制。溶剂剂或小分分子

19、容易易渗入聚聚合物基基质中，因因为小分分子在聚聚合物基基质中的的传质比比在陶瓷瓷性基质质中慢，所所以造成成小分子子在这种种基质中中柱效低低。对于于大分子子像蛋白白质或合合成的高高聚物，聚聚合物基基质的效效能比得得上陶瓷瓷性基质质。因此此，聚合合物基质质广泛用用于分离离大分子子物质。B基质质的选择择硅胶基质质的填料料被用于于大部分分的HPPLC分分析，尤尤其是小小分子量量的被分分析物，聚聚合物填填料用于于大分子子量的被被分析物物质，主主要用来来制成分分子排阻阻和离子子交换柱柱。硅胶氧化铝苯乙烯-二乙烯烯苯甲基丙烯烯酸酯耐有机溶溶剂+适用pHH范围+抗膨胀/收缩+耐压+表面化学学性质+效能+注：+

20、好+一般般+差（2）化化学键合合固定相相将有机官官能团通通过化学学反应共共价键合合到硅胶胶表面的的游离羟羟基上而而形成的的固定相相称为化化学键合合相。这这类固定定相的突突出特点点是耐溶溶剂冲洗洗，并且且可以通通过改变变键合相相有机官官能团的的类型来来改变分分离的选选择性。A键合合相的性性质目前，化化学键合合相广泛泛采用微微粒多孔孔硅胶为为基体，用用烷烃二二甲基氯氯硅烷或或烷氧基基硅烷与与硅胶表表面的游游离硅醇醇基反应应，形成成Si-O-SSi-CC键形的的单分子子膜而制制得。硅硅胶表面面的硅醇醇基密度度约为55个/nnm2，由由于空间间位阻效效应（不不可能将将较大的的有机官官能团键键合到全全部

21、硅醇醇基上）和和其它因因素的影影响，使使得大约约有400500%的硅硅醇基未未反应。残余的硅硅醇基对对键合相相的性能能有很大大影响，特特别是对对非极性性键合相相，它可可以减小小键合相相表面的的疏水性性，对极极性溶质质（特别别是碱性性化合物物）产生生次级化化学吸附附，从而而使保留留机制复复杂化（使使溶质在在两相间间的平衡衡速度减减慢，降降低了键键合相填填料的稳稳定性。结果使使碱性组组分的峰峰形拖尾尾）。为为尽量减减少残余余硅醇基基，一般般在键合合反应后后，要用用三甲基基氯硅烷烷(TMMCS)等进行行钝化处处理，称称封端（或或称封尾尾、封顶顶，ennd-ccapppingg），以以提高键键合相的的

22、稳定性性。另一一方面，也也有些OODS填填料是不不封尾的的，以使使其与水水系流动动相有更更好的“湿湿润”性性能。由于不同同生产厂厂家所用用的硅胶胶、硅烷烷化试剂剂和反应应条件不不同，因因此具有有相同键键合基团团的键合合相，其其表面有有机官能能团的键键合量往往往差别别很大，使使其产品品性能有有很大的的不同。键合相相的键合合量常用用含碳量量(C%)来表表示，也也可以用用覆盖度度来表示示。所谓谓覆盖度度是指参参与反应应的硅醇醇基数目目占硅胶胶表面硅硅醇基总总数的比比例。pH值对对以硅胶胶为基质质的键合合相的稳稳定性有有很大的的影响，一一般来说说，硅胶胶键合相相应在ppH=228的的介质中中使用。B键

23、合合相的种种类化学键合合相按键键合官能能团的极极性分为为极性和和非极性性键合相相两种。常用的极极性键合合相主要要有氰基基(-CCN)、氨基(-NHH2)和和二醇基基(DIIOL)键合相相。极性性键合相相常用作作正相色色谱，混混合物在在极性键键合相上上的分离离主要是是基于极极性键合合基团与与溶质分分子间的的氢键作作用，极极性强的的组分保保留值较较大。极极性键合合相有时时也可作作反相色色谱的固固定相。常用的非非极性键键合相主主要有各各种烷基基(C11C118)和和苯基、苯甲基基等，以以C188应用最最广。非非极性键键合相的的烷基链链长对样样品容量量、溶质质的保留留值和分分离选择择性都有有影响，一一

24、般来说说，样品品容量随随烷基链链长增加加而增大大，且长长链烷基基可使溶溶质的保保留值增增大，并并常常可可改善分分离的选选择性；但短链链烷基键键合相具具有较高高的覆盖盖度，分分离极性性化合物物时可得得到对称称性较好好的色谱谱峰。苯苯基键合合相与短短链烷基基键合相相的性质质相似。另外C118柱稳稳定性较较高，这这是由于于长的烷烷基链保保护了硅硅胶基质质的缘故故，但CC18基基团空间间体积较较大，使使有效孔孔径变小小，分离离大分子子化合物物时柱效效较低。C固定定相的选选择分离中等等极性和和极性较较强的化化合物可可选择极极性键合合相。氰氰基键合合相对双双键异构构体或含含双键数数不等的的环状化化合物的的

25、分离有有较好的的选择性性。氨基基键合相相具有较较强的氢氢键结合合能力，对对某些多多官能团团化合物物如甾体体、强心心甙等有有较好的的分离能能力；氨氨基键合合相上的的氨基能能与糖类类分子中中的羟基基产生选选择性相相互作用用，故被被广泛用用于糖类类的分析析，但它它不能用用于分离离羰基化化合物，如如甾酮、还原糖糖等，因因为它们们之间会会发生反反应生成成Schhifff 碱。二醇基基键合相相适用于于分离有有机酸、甾体和和蛋白质质。分离非极极性和极极性较弱弱的化合合物可选选择非极极性键合合相。利利用特殊殊的反相相色谱技技术，例例如反相相离子抑抑制技术术和反相相离子对对色谱法法等，非非极性键键合相也也可用于

26、于分离离离子型或或可离子子化的化化合物。ODSS(Octaadeccyl sillanee)是应应用最为为广泛的的非极性性键合相相，它对对各种类类型的化化合物都都有很强强的适应应能力。短链烷烷基键合合相能用用于极性性化合物物的分离离，而苯苯基键合合相适用用于分离离芳香化化合物。另外，美美国药典典对色谱谱法规定定较严，它它规定了了柱的长长度，填填料的种种类和粒粒度，填填料分类类也较详详细，这这样使色色谱图易易于重现现；而中中国药典典仅规定定填料种种类，未未规定柱柱的长度度和粒度度，这使使检验人人员难于于重现实实验，在在某些情情况下还还浪费时时间和试试剂。（3）、流动相相A流动动相的性性质要求求一

27、个理想想的液相相色谱流流动相溶溶剂应具具有低粘粘度、与与检测器器兼容性性好、易易于得到到纯品和和低毒性性等特征征。选好填料料（固定定相）后后，强溶溶剂使溶溶质在填填料表面面的吸附附减少，相相应的容容量因子子k降低低；而较较弱的溶溶剂使溶溶质在填填料表面面吸附增增加，相相应的容容量因子子k升高高。因此此，k值值是流动动相组成成的函数数。塔板板数N一一般与流流动相的的粘度成成反比。所以选选择流动动相时应应考虑以以下几个个方面：流动相相应不改改变填料料的任何何性质。低交联联度的离离子交换换树脂和和排阻色色谱填料料有时遇遇到某些些有机相相会溶胀胀或收缩缩，从而而改变色色谱柱填填床的性性质。碱碱性流动动

28、相不能能用于硅硅胶柱系系统。酸酸性流动动相不能能用于氧氧化铝、氧化镁镁等吸附附剂的柱柱系统。纯度。色谱柱柱的寿命命与大量量流动相相通过有有关，特特别是当当溶剂所所含杂质质在柱上上积累时时。必须与与检测器器匹配。使用UUV检测测器时，所所用流动动相在检检测波长长下应没没有吸收收，或吸吸收很小小。当使使用示差差折光检检测器时时，应选选择折光光系数与与样品差差别较大大的溶剂剂作流动动相，以以提高灵灵敏度。粘度要要低（应应2ccp）。高粘度度溶剂会会影响溶溶质的扩扩散、传传质，降降低柱效效，还会会使柱压压降增加加，使分分离时间间延长。最好选选择沸点点在1000以以下的流流动相。对样品品的溶解解度要适适

29、宜。如如果溶解解度欠佳佳，样品品会在柱柱头沉淀淀，不但但影响了了纯化分分离，且且会使柱柱子恶化化。样品易易于回收收。应选选用挥发发性溶剂剂。B流动动相的选选择在化学键键合相色色谱法中中，溶剂剂的洗脱脱能力直直接与它它的极性性相关。在正相相色谱中中，溶剂剂的强度度随极性性的增强强而增加加；在反反相色谱谱中，溶溶剂的强强度随极极性的增增强而减减弱。正相色谱谱的流动动相通常常采用烷烷烃加适适量极性性调整剂剂。反相色谱谱的流动动相通常常以水作作基础溶溶剂，再再加入一一定量的的能与水水互溶的的极性调调整剂，如如甲醇、乙腈、四氢呋呋喃等。极性调调整剂的的性质及及其所占占比例对对溶质的的保留值值和分离离选择

30、性性有显著著影响。一般情情况下，甲甲醇-水水系统已已能满足足多数样样品的分分离要求求，且流流动相粘粘度小、价格低低，是反反相色谱谱最常用用的流动动相。但但Snyyderr则推荐荐采用乙乙腈-水水系统做做初始实实验，因因为与甲甲醇相比比，乙腈腈的溶剂剂强度较较高且粘粘度较小小，并可可满足在在紫外11852055nm处处检测的的要求，因因此，综综合来看看，乙腈腈-水系系统要优优于甲醇醇-水系系统。在分离含含极性差差别较大大的多组组分样品品时，为为了使各各组分均均有合适适的k值值并分离离良好，也也需采用用梯度洗洗脱技术术。参考资料料：乙腈的毒毒性是甲甲醇的55倍，是是乙醇的的25倍倍。价格格是甲醇醇

31、的67倍。反相色谱谱中，如如果要在在相同的的时间内内分离同同一组样样品，甲甲醇/水水作为冲冲洗剂时时其冲洗洗强度配配比与乙乙腈/水水或四氢氢呋喃/水的冲冲洗强度度配比有有如下关关系：C乙腈0.332C 2甲醇醇0.557C甲甲醇C四氢呋呋喃0.666C甲甲醇C为不同同有机溶溶剂与水水混合的的体积百百分含量量。1000%甲甲醇的冲冲洗强度度相当于于89%的乙腈腈/水或或66%的四氢氢呋喃/水的冲冲洗强度度。C流动动相的ppH值采用反相相色谱法法分离弱弱酸（33pKKa77）或弱弱碱（77pKKa88）样品品时，通通过调节节流动相相的pHH值，以以抑制样样品组分分的解离离，增加加组分在在固定相相上

32、的保保留，并并改善峰峰形的技技术称为为反相离离子抑制制技术。对于弱弱酸，流流动相的的pH值值越小，组组分的kk值越大大，当ppH值远远远小于于弱酸的的pKaa值时，弱弱酸主要要以分子子形式存存在；对对弱碱，情情况相反反。分析析弱酸样样品时，通通常在流流动相中中加入少少量弱酸酸，常用用50mmmoll/L磷磷酸盐缓缓冲液和和1%醋醋酸溶液液；分析析弱碱样样品时，通通常在流流动相中中加入少少量弱碱碱，常用用50mmmoll/L磷磷酸盐缓缓冲液和和30mmmoll/L三三乙胺溶溶液。注：流动动相中加加入有机机胺可以以减弱碱碱性溶质质与残余余硅醇基基的强相相互作用用，减轻轻或消除除峰拖尾尾现象。所以在

33、在这种情情况下有有机胺（如如三乙胺胺）又称称为减尾尾剂或除除尾剂。D流动动相的脱脱气HPLCC所用流流动相必必须预先先脱气，否否则容易易在系统统内逸出出气泡，影影响泵的的工作。气泡还还会影响响柱的分分离效率率，影响响检测器器的灵敏敏度、基基线稳定定性，甚甚至使无无法检测测。（噪噪声增大大，基线线不稳，突突然跳动动）。此此外，溶溶解在流流动相中中的氧还还可能与与样品、流动相相甚至固固定相（如如烷基胺胺）反应应。溶解解气体还还会引起起溶剂ppH的变变化，对对分离或或分析结结果带来来误差。溶解氧能能与某些些溶剂（如如甲醇、四氢呋呋喃）形形成有紫紫外吸收收的络合合物，此此络合物物会提高高背景吸吸收（特

34、特别是在在2600nm以以下），并并导致检检测灵敏敏度的轻轻微降低低，但更更重要的的是，会会在梯度度淋洗时时造成基基线漂移移或形成成鬼峰（假假峰）。在荧光光检测中中，溶解解氧在一一定条件件下还会会引起淬淬灭现象象，特别别是对芳芳香烃、脂肪醛醛、酮等等。在某某些情况况下，荧荧光响应应可降低低达955%。在在电化学学检测中中（特别别是还原原电化学学法），氧氧的影响响更大。除去流动动相中的的溶解氧氧将大大大提高UUV检测测器的性性能，也也将改善善在一些些荧光检检测应用用中的灵灵敏度。常用的的脱气方方法有：加热煮煮沸、抽抽真空、超声、吹氦等等。对混混合溶剂剂，若采采用抽气气或煮沸沸法，则则需要考考虑低

35、沸沸点溶剂剂挥发造造成的组组成变化化。超声声脱气比比较好，110220分钟钟的超声声处理对对许多有有机溶剂剂或有机机溶剂/水混合合液的脱脱气是足足够了（一一般5000mll溶液需需超声220330miin方可可），此此法不影影响溶剂剂组成。超声时时应注意意避免溶溶剂瓶与与超声槽槽底部或或壁接触触，以免免玻璃瓶瓶破裂，容容器内液液面不要要高出水水面太多多。离线（系系统外）脱脱气法不不能维持持溶剂的的脱气状状态，在在你停止止脱气后后，气体体立即开开始回到到溶剂中中。在114小小时内，溶溶剂又将将被环境境气体所所饱和。在线（系系统内）脱脱气法无无此缺点点。最常常用的在在线脱气气法为鼓鼓泡，即即在色谱

36、谱操作前前和进行行时，将将惰性气气体喷入入溶剂中中。严格格来说，此此方法不不能将溶溶剂脱气气，它只只是用一一种低溶溶解度的的惰性气气体（通通常是氦氦）将空空气替换换出来。此外还还有在线线脱气机机。一般说来来有机溶溶剂中的的气体易易脱除，而而水溶液液中的气气体较顽顽固。在在溶液中中吹氦是是相当有有效的脱脱气方法法，这种种连续脱脱气法在在电化学学检测时时经常使使用。但但氦气昂昂贵，难难于普及及。E流动动相的滤滤过所有溶剂剂使用前前都必须须经0.45&miccro;m（或或0.222&mmicrro;mm）滤过过，以除除去杂质质微粒，色色谱纯试试剂也不不例外（除除非在标标签上标标明“已已滤过”）。用

37、滤膜过过滤时，特特别要注注意分清清有机相相（脂溶溶性）滤滤膜和水水相（水水溶性）滤滤膜。有有机相滤滤膜一般般用于过过滤有机机溶剂，过过滤水溶溶液时流流速低或或滤不动动。水相相滤膜只只能用于于过滤水水溶液，严严禁用于于有机溶溶剂，否否则滤膜膜会被溶溶解！溶溶有滤膜膜的溶剂剂不得用用于HPPLC。对于混混合流动动相，可可在混合合前分别别滤过，如如需混合合后滤过过，首选选有机相相滤膜。现在已已有混合合型滤膜膜出售。F流动动相的贮贮存流动相一一般贮存存于玻璃璃、聚四四氟乙烯烯或不锈锈钢容器器内，不不能贮存存在塑料料容器中中。因许许多有机机溶剂如如甲醇、乙酸等等可浸出出塑料表表面的增增塑剂，导导致溶剂剂

38、受污染染。这种种被污染染的溶剂剂如用于于HPLLC系统统，可能能造成柱柱效降低低。贮存存容器一一定要盖盖严，防防止溶剂剂挥发引引起组成成变化，也也防止氧氧和二氧氧化碳溶溶入流动动相。磷酸盐、乙酸盐盐缓冲液液很易长长霉，应应尽量新新鲜配制制使用，不不要贮存存。如确确需贮存存，可在在冰箱内内冷藏，并并在3天天内使用用，用前前应重新新滤过。容器应应定期清清洗，特特别是盛盛水、缓缓冲液和和混合溶溶液的瓶瓶子，以以除去底底部的杂杂质沉淀淀和可能能生长的的微生物物。因甲甲醇有防防腐作用用，所以以盛甲醇醇的瓶子子无此现现象。G卤代代有机溶溶剂应特特别注意意的问题题卤代溶剂剂可能含含有微量量的酸性性杂质，能能

39、与HPPLC系系统中的的不锈钢钢反应。卤代溶溶剂与水水的混合合物比较较容易分分解，不不能存放放太久。卤代溶溶剂（如如CCll4、CCHCll3等）与与各种醚醚类（如如乙醚、二异丙丙醚、四四氢呋喃喃等）混混合后，可可能会反反应生成成一些对对不锈钢钢有较大大腐蚀性性的产物物，这种种混合流流动相应应尽量不不采用，或或新鲜配配制。此此外，卤卤代溶剂剂（如CCH2CCl2）与与一些反反应性有有机溶剂剂（如乙乙腈）混混合静置置时，还还会产生生结晶。总之，卤卤代溶剂剂最好新新鲜配制制使用。如果是是和干燥燥的饱和和烷烃混混合，则则不会产产生类似似问题。HHPPLC用用水HPLCC应用中中要求超超纯水，如如检测

40、器器基线的的校正和和反相柱柱的洗脱脱。进行HPPLC、GC、电泳和和荧光分分析，或或在涉及及组织培培养时，没没有有机机物污染染是非常常重要的的。测高高锰酸钾钾颜色保保留时间间的定性性方法反反应慢，对对很低水水平的有有机物（对对HPLLC可能能还是太太高了）不不够灵敏敏，特别别是不能能定量。总有机机碳(TTOC)分析仪仪（把有有机物氧氧化成CCO2，测测游离的的CO22）常用用于I类类（NCCCLSS）水中中低浓度度有机物物的测定定。I类水标标准：NCCLLSASTMM电阻率，MMccm，225，最最小10.0018.00硅酸盐，mmg/LL，最大大0.0550.0003微粒，&miccro;m

41、滤器器0.2220.2微生物，CCFU/ml10分三档美国药典典24版版（20000年年）要求求TOCC0.5 mmg/LL（用标标准蔗糖糖溶液11.199 mgg/L），电电导率在在室温ppH 66时22.4 &miicroo;S/cm（即即0.42 Mcm）。HPLLC级水水增加吸吸收特性性：在11cm池池中，用用超纯水水作空白白，在1190nnm、2200nnm和22504000nm的的吸收度度分别不不得过00.011、0.01和和0.005。增增加不挥挥发物，3pppm（中中国药典典纯水10pppm）。二、LaabAllliaancee 液相相色谱系系统组成成泵进样器色谱柱（柱柱温箱）

42、检测器工作站柱后衍生生装置调节流速开泵/关泵模式切换出口单向阀入口单向阀泵头旁通阀出口过滤器Seriies 泵前前视图 手动进样样阀AS10000/30000自动动进样器器色谱柱201型型检测器器LabAAlliiancce 工工作站界界面三、LaabAllliaancee液相色色谱系统统常见使使用故障障及维护护1、泵的的使用和和维护注注意事项项为了延长长泵的使使用寿命命和维持持其输液液的稳定定性，必必须按照照下列注注意事项项进行操操作：防止任任何固体体微粒进进入泵体体，因为为尘埃或或其它任任何杂质质微粒都都会磨损损柱塞、密封圈圈、缸体体和单向向阀，因因此应预预先除去去流动相相中的任任何固体体

43、微粒。流动相相最好用用微孔滤膜膜（0.2或0.445umm）过滤。泵泵的入口口都应连连接0.2umm过滤头头（或片片）。泵泵的滤头头应经常常清洗或或更换。流动相相不应含含有任何何腐蚀性性物质，含含有缓冲冲液的流流动相不不应保留留在泵内内，尤其其是在停停泵过夜夜或更长长时间的的情况下下。如果果将含缓缓冲液的的流动相相留在泵泵内，由由于蒸发发或泄漏漏，甚至至只是由由于溶液液的静置置，就可可能析出出盐的微微细晶体体，这些些晶体将将和上述述固体微微粒一样样损坏密密封环和和柱塞等等。因此此，必须须泵入纯纯水将泵泵充分清清洗后，再再换成适适合于色色谱柱保保存和有有利于泵泵维护的的溶剂（对对于反相相键合硅硅

44、胶固定定相，可可以是甲甲醇或甲甲醇-水水）。泵工作作时要留留心防止止溶剂瓶瓶内的流流动相被被用完，否否则空泵泵运转也也会磨损损柱塞、缸体或或密封环环，最终终产生漏漏液。输液泵泵的工作作压力决决不要超超过规定定的最高高压力，否否则会使使高压密密封环变变形，产产生漏液液。流动相相应该先先脱气，以以免在泵泵内产生生气泡，影影响流量量的稳定定性，如如果有大大量气泡泡，泵就就无法正正常工作作。如果输液液泵产生生故障，须须查明原原因，采采取相应应措施排排除故障障：没有流动动相流出出，又无无压力指指示。原原因可能能是泵内内有大量量气体，这这时可打打开排气气阀，用用一个550mll针筒在在泵出口口处抽出出气体

45、。另一个个可能原原因是密密封环磨磨损，需需更换。压力和和流量不不稳。原原因可能能是气泡泡，需要要排除；或者是是单向阀阀内有异异物，可可卸下单单向阀，浸浸入甲醇醇水溶液液中超声声清洗。有时可可能是流流动相滤滤头内有气气泡，或或被盐的的微细晶晶粒或滋滋生的微微生物部部分堵塞塞，这时时，可卸卸下滤头浸入甲醇醇水溶液液内超声声除气泡泡。压力过过高的原原因是管管路被堵堵塞，需需要清除除和清洗洗。压力力降低的的原因则则可能是是管路有有泄漏。检查堵堵塞或泄泄漏时应应逐段进进行。2、手动动进样阀和和自动进进样器。现在大都都使用六六通进样样阀或自自动进样样器。进进样装置置要求：密封性性好，死死体积小小，重复复性

46、好，保保证中心心进样，进进样时对对色谱系系统的压压力、流流量影响响小。手动进样样阀和自动动进样器器的维护护注意事事项包括括：样样品溶液液进样前前必须用用0.445umm滤膜过过滤，以以减少微微粒对进进样阀的的磨损。转动动阀芯时时不能太太慢，更更不能停停留在中中间位置置，否则则流动相相受阻，使使泵内压压力剧增增，甚至至超过泵泵的最大大压力；再转到到进样位位时，过过高的压压力将使使柱头损损坏。为防止止缓冲盐盐和样品品残留在在进样阀阀中，每每次分析析结束后后应冲洗洗进样阀阀。通常常可用水水冲洗，或或先用能能溶解样样品的溶溶剂冲洗洗，再用用水冲洗洗。3、色谱谱柱的维维护色谱是一一种分离离分析手手段，分

47、分离是核核心，因因此担负负分离作作用的色色谱柱是是色谱系系统的心心脏。对对色谱柱柱的要求求是柱效效高、选选择性好好，分析析速度快快等。市市售的用用于HPPLC的的各种微微粒填料料如多孔孔硅胶以以及以硅硅胶为基基质的键键合相、氧化铝铝、有机机聚合物物微球（包包括离子子交换树树脂）、多孔碳碳等，其其粒度一一般为33,5,7,110mm等，柱柱效理论论值可达达5116万/米。对对于一般般的分析析只需550000塔板数数的柱效效；对于于同系物物分析，只只要5000即可可；对于于较难分分离物质质对则可可采用高高达2万万的柱子子，因此此一般110330cmm左右的的柱长就就能满足足复杂混混合物分分析的需需

48、要。柱效受柱柱内外因因素影响响，为使使色谱柱柱达到最最佳效率率，除柱柱外死体体积要小小外，还还要有合合理的柱柱结构（尽尽可能减减少填充充床以外外的死体体积）及及装填技技术。即即使最好好的装填填技术，在在柱中心心部位和和沿管壁壁部位的的填充情情况总是是不一样样的，靠靠近管壁壁的部位位比较疏疏松，易易产生沟沟流，流流速较快快，影响响冲洗剂剂的流形形，使谱谱带加宽宽，这就就是管壁壁效应。这种管管壁区大大约是从从管壁向向内算起起30倍倍粒径的的厚度。在一般般的液相相色谱系系统中，柱柱外效应应对柱效效的影响响远远大大于管壁壁效应。1柱的的构造色谱柱由由柱管、压帽、卡套（密密封环）、筛板（滤滤片）、接头、

49、螺丝等等组成。柱管多多用不锈锈钢制成成，压力力不高于于70 kg/cm22时，也也可采用用厚壁玻玻璃或石石英管，管管内壁要要求有很很高的光光洁度。为提高高柱效，减减小管壁壁效应，不不锈钢柱柱内壁多多经过抛抛光。也也有人在在不锈钢钢柱内壁壁涂敷氟氟塑料以以提高内内壁的光光洁度，其其效果与与抛光相相同。还还有使用用熔融硅硅或玻璃璃衬里的的，用于于细管柱柱。色谱谱柱两端端的柱接接头内装装有筛板板，是烧烧结不锈锈钢或钛钛合金，孔孔径0.2220&mmicrro;mm(510&miccro;m)，取取决于填填料粒度度，目的的是防止止填料漏漏出。色谱柱按按用途可可分为分分析型和和制备型型两类，尺尺寸规格格

50、也不同同：常常规分析析柱（常常量柱），内内径25mmm（常用用4.66mm，国国内有44mm和和5mmm），柱柱长100300cm；窄径径柱（nnarrrow borre，又又称细管管径柱、半微柱柱semmi-mmicrrocoolummn），内内径12mmm，柱长长1020ccm；毛细管管柱（又又称微柱柱miccroccoluumn），内内径0.200.5mmm；半制备备柱，内内径55mm；实验验室制备备柱，内内径200400mm，柱柱长100300cm；生产产制备柱柱内径可可达几十十厘米。柱内径径一般是是根据柱柱长、填填料粒径径和折合合流速来来确定，目目的是为为了避免免管壁效效应。2柱的的

51、发展方方向因强调分分析速度度而发展展出短柱柱，柱长长3110cmm，填料料粒径223&miccro;m。为为提高分分析灵敏敏度，与与质谱(MS)联接，而而发展出出窄径柱柱、毛细细管柱和和内径小小于0.2mmm的微径径柱（mmicrroboore）。细管径径柱的优优点是：节省省流动相相；灵灵敏度增增加；样品量量少；能使用用长柱达达到高分分离度；容易易控制柱柱温；易于实实现LCC-MSS联用。但由于柱柱体积越越来越小小，柱外外效应的的影响就就更加显显著，需需要更小小池体积积的检测测器（甚甚至采用用柱上检检测），更更小死体体积的柱柱接头和和连接部部件。配配套使用用的设备备应具备备如下性性能：输输液泵

52、能能精密输输出11000&miicroo;l/minn的低流流量，进进样阀能能准确、重复地地进样微微小体积积的样品品。且因因上样量量小，要要求高灵灵敏度的的检测器器，电化化学检测测器和质质谱仪在在这方面面具有突突出优点点。3色谱谱柱的使使用和维维护注意意事项色谱柱的的正确使使用和维维护十分分重要，稍稍有不慎慎就会降降低柱效效、缩短短使用寿寿命甚至至损坏。在色谱谱操作过过程中，需需要注意意下列问问题，以以维护色色谱柱。避免免压力和和温度的的急剧变变化及任任何机械械震动。温度的的突然变变化或者者使色谱谱柱从高高处掉下下都会影影响柱内内的填充充状况；柱压的的突然升升高或降降低也会会冲动柱柱内填料料，因此此在调节节流速时时应该缓缓慢进行行，在阀阀进样时时阀的转转动不能能过缓（如如前所述述）。应逐逐渐改变变溶剂的的组成，特特别是反反相色谱谱中，不不应直接接从有机机溶剂改改变为全全部是水水，反之之亦然。一般般说来色色谱柱不不能反冲冲，只有有生产者者指明该该柱可以以反冲时时，才可可以反冲冲除去留留在柱头头的杂质质。否则则反冲会会迅速降降低柱效效。选择择使用适适宜的流流动相（尤尤其是ppH），以以避免固固定相被被破坏。有时可可以在进进样器前前面连接接一预柱柱，分析析柱是键键合硅胶胶时，预预柱为硅硅胶，可可使流动动相在进进入分析析柱之前前预先被被硅胶“饱