彗星试验方法

1、主要仪器数显电热恒温水浴箱、电泳仪、电子分析天平、荧光显微镜及数码成像系统、匀浆器、磁力搅 拌器。主要试剂氯化镉（CdCl225H2O），分析纯，上海亭新化工试剂厂，批号20080901。使用时用去离子水配 制成不同浓度。正常熔点琼脂糖（NMA），低熔点琼脂糖（LMA），N-十二烷基肌氨酸钠，Triton-X-100，漠化 乙锭（EB）。氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），乙二胺四乙酸二钠 （Na2EDTA），三（羟甲基）胺基甲烷（Tris），氢氧化钠（NaOH），二甲基亚飒（DMSO），盐酸（HCl） 等，均为国产分析纯试剂。主要溶液的配制磷

2、酸缓冲液（PBS） NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，无 Ca2+、Mg2+ 双蒸水1000ml，调pH至7.4，冰箱4C保存备用。0.5%正常熔点琼脂糖（NMA） 0.5g NMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4C 保存备用。0.5%低熔点琼脂糖（LMA） 0.5g LMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4 C 保存备用。细胞裂解液 精确称取NaCl 146.1g，Na2EDTA 37.2 g，N-十二烷基肌氨酸钠10 g，Tris 1.22 g， 放入1000 ml烧杯中，加800ml双蒸水，磁

3、力搅拌溶解（可加热），以4 mol/L NaOH调pH到10.0， 在容量瓶中加水定容到1000 ml。冰箱4C保存备用。临用前根据用量按总体积加1% Triton-X-100， 10% DMSO 混匀。碱性电泳缓冲液 Na2EDTA 0.186g NaOH 6g，加500ml双蒸水定容，pH13，现配现用。Tris-HCl中和液 称取Tris 48.44g，加600ml双蒸水溶解，用浓盐酸（约13.5ml）调pH值至 7.5，加水定容到1000ml，4C保存备用。EB染色液（0.03mg/ml）漠化乙锭（EB） 3.0mg，双蒸水100ml，避光4C保存备用。试验分组染毒单细胞凝胶电泳试验在

4、染毒第40 d时，各组小鼠摘眼球取血后打开胸腔，左心室插管，右心耳打一切口，生理盐水 快速灌流至动物尸体展开，肢体变硬为止。迅速取肺脏组织，用冰冷的PBS漂洗三次至无血，再用 不锈钢剪刀将其剪碎，加适量PBS液到玻璃匀浆器研磨，并过300目不锈钢筛网，得单细胞悬液。然后以5000r/min离心5min，轻轻吸去上层溶液，再加PBS,冲洗1次，离心后将细胞浓度调整为106107个/ml，台盼兰染色镜检细胞存活率（细胞存活率90%以上），立即进行以下步骤。（1）胶板的制备第一层胶的制备：将已预热56C的80p l 0.5%正常熔点琼脂糖NMA （溶于无Ca2+，Mg2+ 的磷酸缓冲液PBS）滴到同

5、样预热的载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，4C放置10min使其 凝固。第二层胶的制备：取10p l含1000个细胞的PBS和75p l 0.5%低熔点琼脂糖LMA （溶于无 Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）在37C混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的LMA滴到第一层 胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4 C放置10min使其凝固。第三层胶的制备：最后在凝固的LMA层上滴加85p l预热37 C的0.5% LMA，盖上盖玻 片，使其凝固。第一层胶的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞 起保护作用。（2） 细胞裂解 移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的细胞裂解液中至少

6、裂解1h （在放第一片 开始计时，再以同样的顺序取出，确保每张片子裂解时间相同）。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜， 除去蛋白质、RNA等，仅存留核骨架。（3）DNA碱解旋 细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，以去掉载玻片表面高浓度的 盐，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液，约覆过胶面0.25cm。碱解旋 20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA,使DNA断链，在电泳场中易于迁移。（4）单细胞电泳 在25v、300mA条件下电泳20min。（5） 中和与染色电泳完毕后，将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用Tris-HCl （pH7.5） 中和15min

7、。然后每片载玻片上滴加50p l 30p g/mL的漠化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻 片，避光染色20min，即可观察。（6）试验结果观察与数据处理EB染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。每只小鼠的肺组织制一张片子，每张片子随机选择100个肺细胞，计数各组小鼠肺组织的拖尾细 胞数，计算拖尾率，并利用统计软件SPSS 10.0进行X2检验。每只小鼠的每张肺组织片子随机 选择 25 个细胞，利用 Comet Assay Software Pect （CASP 1.2.3 beta 1）图像分析软件 （ HYPERLINK /index.php%ef%bc%89%e5%af%b9%e5%bd%97%e6%98%9f%e5%9b%be%e5%83%8f%e8%bf%9b%e8%a1%8c%e6%8c%87%e6%a0%87%e5%88%86%e6%9e%90%ef%bc%8c%e7%94%a8 /index.php）对彗星图像进行指标分析，用 +SE表示彗星全长（CL）、尾长（T L）、尾矩（TM）和Olive尾距（OTM），并利用统计软件SPSS 10.0分析，显著性比较采用t检验。 根据拖尾细胞中，彗星尾部DNA含量（TDNA%），将细胞DNA损伤程度分为5级。0级：无 损