西南林大生物化学仪器分析技术课件-06电泳技术

1、第四章 电 泳 技 术各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。电泳作为一项生物化学研究的方法是在1937年Tiselius等人改进了电泳仪使之具有高度准确性以后，电泳技术才得到了较大的发展。20世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，并先后找到滤纸，醋酸纤维薄膜，淀粉及琼脂作为支持物。 60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术的应用越来越广泛，从分离

2、小分子，如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的生物大分子，如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定。已成为生化分析分离不可缺少的一门重要技术。电泳基本原理任何带电物质由于其本身的解离作用或表面上吸附其他带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。例如，蛋白质分子是由氨基酸组成的，而氨基酸带有可解离的氨基(一NH3)和羧基(一COO)，是典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电。带电的性质和多少取决于蛋白质分子的性质和溶液的pH以及离子强度。 在某一pH条件下蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零，此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这一pH，称为该蛋白质的等电点(pI)。如果

3、溶液的pH大于pI，则蛋白质分子会解离出H而带负电，此时蛋白质分子在电场中向正极移动。如果溶液的pH值小于pI，则蛋白质分子结合一部分H而带正电，此时蛋白质分子在电场中向负极移动。由于带电颗粒的泳动速度受电场强度影响，使得同一带电颗粒在不同电场中泳动速度是不同的，其泳动情况用迁移率来表示。迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，可用以下公式表示： m=v/E=Q/6rm：迁移率（cm2/Vs）；v：颗粒泳动速度（cm/s）；E：电场强度（V/cm）；Q：被分离物所带净电荷；：介质粘度；r：颗粒半径。由上式可见迁移率与球形颗粒半径、介质粘度、颗粒所带净电荷有关。带电颗粒在电场申的泳动速度与

4、本身所带净电荷的数量，颗粒的大小和形状有关。一般说，所带的电荷数量越多，颗粒越小越接近球形，则在电场中泳动速度越快，反之，则越慢。42 影响迁移率的主要因素迁移率是胶体颗粒的物理常数，可用来鉴定蛋白质以及研究它们的某些物化性质，被分离物质迁移率除受其本身性质影响外，还与其他外界因素有关。影响颗粒迁移率的外界因素讨论如下。421 电场强度也称电位梯度或电势梯度。所谓电场强度是指每厘米支持物的电位差，在一定大小的电场中，带电颗粒的泳动受所用电压的控制，电压越高，带电颗粒泳动越快，同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同。在电泳中，带电颗粒的迁移率与电流成正比，与电阻成反比。根据电场强度的大小，可以将

5、电泳分为常压电泳和高压电泳，前者电场强度为210V/cm，后者为70200V/cm，常压电泳时间长，需数小时到数十小时，高压电泳时间短，有时仅需几分钟。 溶液pH由于蛋白质、氨基酸等的电离度a随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率(U)，即: U=ma 因此，在电泳时选用一定pH的缓冲液非常重要。pH决定带电颗粒的解离程度，在距样品等电点pI越远的pH溶液中，样品所带的电荷量越多。为使电泳时的pH恒定，必须选用适当的缓冲液作为电极缓冲液，颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快;反之，则越慢。因此，分离某种蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH，才能使被分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大的

6、差异，更有利于彼此的分开。423 溶液的离子强度（ionic strenght)离子强度影响颗粒的电动电势，缓冲液离子强度过大，溶液中的离子会分担大部分电流，而使被分离的粒子迁移速度变慢。一般最适的离子强度在0.020.2mol/L之间。一个单单价(如NaCl、KCl)电解质的离子强度就等于其浓度；一个单双价或双单价(如Na2SO4、CaCl2)电解质的离子强度，等于其浓度的三倍。而ZnSO4、CuSO4等双双价电解质的离子强度，就等于其浓度的四倍。因此只要知道溶液的浓度，即可计算出溶液的离子强度。4.2.5 温度的影响电泳过程中由于通电引起温度升高，致使介质粘度下降，颗粒运动加剧引起自由扩散

7、变快，迁移率增加。为防止温度的升高，避免热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，也可将电泳槽置冰箱里进行电泳或在电泳系统中安装冷却散热装置。43 凝 胶 电 泳431聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳方法。它是在淀粉凝胶电泳的基础上发展起来的。此法在分子生物学、生物化学以及临床等方面具有广泛的应用。431l PAGE的优点(1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的多聚体。调节单体浓度或单体和交联剂的比例，就能得到孔径不同、范围广泛的凝胶物质，而且重复性好。(2)化学性能稳定，与被分

8、离物不起化学反应，对温度和pH变化不敏感。(3)聚丙烯胺酰凝胶是CCCCC连接的多聚体，侧链除带有不活泼的胺酰基外，不带有任何其他离子基团，故无电渗作用。(4)聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，弹性大，无色透明，有利于电泳后进行各种处理。(5)设备简单，所需样品量少(1100g)，分辨率较高。用此方法进行超微量分析时，可检出含量在109mol/L左右的样品。PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量分析及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。4312聚丙烯酚胺凝胶的聚合聚丙烯酰胺凝胶是由单体(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂（cro

9、sslinker)，又称为共聚体的N，N一甲叉双丙烯酰胺(methylene bisacrylamide, 简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。在催化剂过硫酸铵ammonium persulfate (NH4) 2S408 ,简称AP和加速剂N，N，N，N一四甲基乙二胺(N，N，N，N一tetramethyl ethylene diamine，简称TEMED)的作用下，聚合含酰胺侧链的脂肪族长链，相邻的两个链由甲叉桥连接起来的三维网孔结构。 催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有两种催化体系（1、化学聚合；2、光聚合。）介绍一种最常用的化学聚合足够用了。1、化学聚

10、合。化学聚合的催化剂一般是过硫酸铵，加速剂是脂肪叔胺，如四甲基乙二胺即TEMED(CH3) 2N一CH2一CH2一N(CH3) 2，三乙醇胺和二甲基氨丙腈等。其中以TEMED为最好。它的碱基可以催化过硫酸铵(NH4)2S2O8立即产生自由硫酸基，硫酸自由基的氧原子激活丙烯酰胺单体连接形成单体长链。含有这种丙烯酰胺单体长链的溶液尽管比较粘稠，但不能形成凝胶。只有当交联剂(Bis)存在时，才能形成凝胶。Bis将单体长链连接成网状结构。在过硫酸铵一TEMED催化系统中，Acr和Bis聚合的初速率与硫酸铵浓度的平方根成正比，并且在碱性条件下反应迅速。此外，温度、氧分子和杂质等都会影响聚合速度。温度较高

11、聚合较快，溶液预先抽气的比不抽气的聚合快。4313 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺量的确定 聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于胶的浓度和交联度(Bis在胶中的分含量)。例如75%的胶，平均孔径5nm，30%的胶孔径为2nm。若Bis与Acr之比由1:15改变到1:60，则明显改变了胶的分子筛性质，使同工酶的相对迁移率增大，如乳酸脱氢酶的相对迁移率由0148变到0273。凝胶的浓度大或交联度大，蛋白质迁移的速度慢，电泳时间长；反之迁移速度快，电泳时间短。 通常凝胶的筛孔、透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的，而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。凝胶总浓度(T)的计算公式如下: T(A+B)/M100

12、% 式中叫代表Acr的重量(g)；B代表交联剂Bis的重量(g);M代表溶液的体积(mL)。 交联度(C)可按下式计算: C=B /(A+B)l00% A与B的比值(W/W)对凝胶的筛孔、透明度和机械强度等性质也有明显影响。A/B l00时，5%凝胶成糊状，且易断裂。由此可知，凝胶浓度不同，其交联度是不同的。交联度随着总浓度的增加而降低。要制备完全透明而又有弹性的凝胶，应将A/B控制在30左右。不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Acr 2%，Bis mPaP mGaG根据有效迁移率的大小区分，把最快的Cl-称为快离子(又称前导离子，leading ion);把最慢的称为慢离子H2N一CH2一C

13、OO-(又称尾随离子，trailing ion)。在电泳刚开始时，三层凝胶(样品胶、浓缩胶和分离胶)中都含有快离子，只是电极缓冲液中含有慢离子。电泳进行时，由于快离子的迁移率最大，因此很快超过蛋白质，于是在快离子后面形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电场强度与电导成反比关系: E = I/在低电导区就产生了较高的电场强度。这种环境使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质的迁移率与电场强度的乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同。在快离子和慢离子移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一稳定而又不断向阳极移动的界面，也就是说，在高电场强度区和低电场强度

14、区之间形成一个迅速移动的界面。由于样品蛋白质的有效迁移率正好介于快、慢离子之间，因而它就聚集在这个移动界面的附近，被浓缩为一个狭窄的中间层。一般样品可浓缩300多倍。样品被浓缩的程度与其本身浓度无关，而起决定作用的因子是Cl的浓度，当Cl浓度高时，样品被浓缩的程度也高。当样品进入pH89的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此Cl及H2NCH2COO-沿着离子界面继续前进，蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，然后再分成多个区带。因此，浓缩胶与分离胶之间pH的不连续性是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。在样品胶和浓缩胶中，要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率

15、低，以使样品夹在快慢离子之间被浓缩。进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响 。(2)电荷效应。蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，并形成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载的有效电荷不同，故迁移率不同，所以各种蛋白质样品经分离胶电泳后，若样品组分的相对分子质量相等，则它们就以电荷顺序一条带一条带地排列起来。(3)分子筛效应。相对分子质量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时所受摩擦不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率即为分子筛效应。蛋白质样品在均一的电场强度和pH条件下通过一定孔径的分离胶，相对分子质量小且为球形的蛋白

16、质分子所受阻力小，移动速度快，走在前面;反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作(1)制备凝胶。把含有一定浓度的Acr和Bis与引发剂的电泳胶缓冲液抽真空，同时将电泳槽下槽底部加1%琼脂封口，如果是圆盘电泳，则是把一端用玻璃棒将橡皮管塞住的玻璃管垂直放着，向抽真空的溶液中再加入加速剂（TEMED），即可把分离胶溶液加入管子内或两玻璃板之间，高度为2/3左右，用注射器小心地在胶液的表面上盖上一层水，使胶有一个水平的表面，并与空气隔绝，有利于凝胶的聚合。凝胶形成后，可看到一个清晰的界面，吸去覆盖的水层，在分离胶上加浓缩胶后，插进

17、梳子，待胶凝固后再拔出梳子。(2)加样将样品与甘油或蔗糖混合，直接加在浓缩胶面上，含高浓度盐的样品要在电泳前透析去盐，必须使样品溶液电导低于分离胶的电导才能达到预期的浓缩效果。(3)电泳。胶做好后，把玻璃管或玻板置入电泳槽，安装好后，上、下槽都加入电极缓冲液通电，上槽接负极，下槽接正极，等到染料走到离底部lcm处为止，断掉电源，取下玻管或玻板。(4)样品固定、染色和脱色432 琼脂糖凝胶电泳4321琼脂糖凝胶的性质琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖由D-半乳糖和L-半乳糖连接构成不带电荷的多糖链，这种多糖链在l00左右时呈液态，当温度下降到45以下时，它们之间以氢键方式相

18、互连接成线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。在pH4.09.0的缓冲液中是稳定的。用琼脂糖凝胶分离双链DNA时，其迁移率大小主要与样品的相对分子质量有关，而与核酸的一级结构以及碱基的组成无关。这种方法具有操作方便、设备简单、需样品量少、分辨能力高等优点，是基因工程研究中常用的一门生物技术。 琼脂糖凝胶电泳的优点可归纳如下。(1)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98%，卯%)，近似自由电泳，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(2)琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直接用紫外检测;电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。(3)操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可

19、进行电泳。琼脂糖凝胶电泳可用于核酸的分离鉴定，为DNA相对分子质量测定提供了重要手段。4322凝胶浓度的选择琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用与胶的浓度有密切关系。不同浓度的凝胶，可获得不同大小的孔径。故应根据需要选择适当浓度的凝胶。4323 电极缓冲液琼脂糖凝胶电极缓冲液有TAE、TBE、TPE和碱性缓冲液。其配方是:(1)5OTAE缓冲液。242gTris+57.1冰醋酸+l00mL O.5 mol/LEDTA(pH8.0)定容至1000mL，室温放置。(2)5TBE缓冲液。54gTris+27.5g硼酸+2O mL O.5 mol/L EDTA调pH8.0，加水定容至1000mL，室温放置。

20、TAE缓冲能力弱，在长时间电泳中缓冲能力逐渐丧失。因此，重复使用次数少。而TBE的缓冲能力较强，可重复使用数次。4324 琼脂凝胶电泳操作 (1)制板。一般常用琼脂板最合适的浓度为07%15%。称取一定量的琼脂糖盛入玻璃瓶中，按所需凝胶的浓度加入适量的电极缓冲液（已灭菌），在微波炉中加热至沸腾熔化约10min。待该溶液冷却到60左右，加溴化乙锭使之最后浓度为0.5g/mL。摇匀后即可制胶。温放置约30min后，小心地移走梳子，即制成了琼脂糖凝胶板。(2)加样、电泳及检测。 将琼脂糖凝胶板移至电泳槽后，注入缓冲液(液面高于胶面)。核酸样品浓度为0.10.6g/l,样品一般与比重大的蔗糖或甘油混合

21、，同时加入一定量的指示剂(0.25%漠酚蓝)，加核酸样品110g，样品一般加在琼脂板靠近一端的梳子孔，接通电源，调节电压，一般电压高，跑得快，但分辨率差;电压低，跑得慢，分辨率高。一般维持在5V/cm左右，当漠酚蓝移至阳极端时，关闭电源。核酸已被胶中的EB染色，可置于紫外灯下观察。434 等电聚焦电泳利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酚胺为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholyes,瑞典LKB公司生产的两性载体商品名为Ampholine)，在电场作用下，蛋白质在pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pI的pH处，则不再泳动，而浓缩成狭窄的区带，这种分离蛋白质的方法称为聚丙烯

22、酞胺凝胶等电聚焦电泳(isoelectric focusing，简称IEF)。等电聚焦电泳简称等电聚焦。4341基本原理等电聚焦就是在一定抗对流介质(如凝胶)中放人载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相同的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。(l)pH梯度的形成当一些两性电解质在支持物中，它们在阳极的酸性介质时会得到质子带正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子带负电，这样就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。看其中酸性最强的两性电解质(甲)，当它由阴极泳动到阳极端支持物时，与阳极溶液电

23、离出来的H中和，会失去电荷而停止运动，它所在位置是它的pI。若有另一个pI稍高于甲的物质(乙)，它排在甲的阴极侧。若有很多两性电解质就会依pI递增的次序，在支持物中从阳极排向阴极，形成平稳的由阳极到阴极逐步上升的pH梯度。(2)等电聚焦分离蛋白质的过程。蛋白质是典型的两性电解质物质。它所携带的电荷是随着溶液pH的变化而变化的。即在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷。因此，蛋白质在外加电场作用下或向正极或向负极移动。例如，当一个等电点为pIa的蛋白质置于具有从正极向负极逐渐递增的pH梯度的支持物的阴极端时，因其处于碱性环境中，其带负电荷，故在电场作用下将向正极移动，当移动到pH等于其pIa的区域时，泳动将停止。如果把此蛋白质放在阳极端，则其带正电荷，向负极移动，最后也会泳动到pIa的pH区域。因此，无论把蛋