复旦大学基因诊断与基金治疗教案04-2基因诊断技术与方法（下）

1、第四章 基因诊断技术与方法（下）2 聚合酶链反应 1985年由美国Cetus公司的Kary Mullis首创了一种极为简便和快速地能在体外进行扩增DNA的技术，在很短时间内，数量上仅几个拷贝的基因可放大上百万倍，极大地提高了DNA扩增率，这就是聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)，Mullis因此获得了1993年诺贝尔医学奖。现在，PCR已成为基因诊断技术中普遍应用的技术。2.1 聚合酶链反应的基本原理PCR实际上是以DNA为模板，在4种核苷酸存在的条件下，借DNA聚合酶的作用而产生的酶促合成反应。PCR反应最重要的组分是引物，也就是从模板DNA双链选取

2、一段特定序列再在体外合成的寡核酸链。PCR之所以能够发生，依赖于在加热条件下，双链DNA解离形成单链（变性），当温度骤然降低（复性）时，在反应环境中的引物能特异地与这些单链相结合，同时使种核苷酸在DNA聚合酶的作用下，发生以引物为起点从53端进行聚合的现象，遂使DNA链不断延伸2.2 聚合酶链反应过程2.2.1 PCR 基本步骤 变性(denaturation)：常规采用94，在高温条件下使模板DNA(待扩增DNA)氢键断裂，解链成为单链模板； 退火(annealing)：人工合成的两个寡聚核苷酸引物在较低温度下，分别与单链模板DNA链形成杂交链； 延伸(extension)：在72条件下，D

3、NA聚合酶将单核苷酸在引物3端掺入，沿模板53方向延伸，合成新的DNA链。2.2.2 PCR条件的要求和建立 PCR反应中的主要成份模板DNA引物Taq DNA聚合酶PCR缓冲液三磷酸脱氧核苷(dNTPs) 底物.1 PCR缓冲液 一个标准的50100l反应体系应包括：500.0mmol/L KCl100.0mmol/L TrisHCl(pH8.4)1.5mmol/L MgCl2100.0g/ml明胶或牛血清白蛋白(BSA)4种单核苷酸(dATP+dCTP+dGTP+dTTP)各200250M.1.2 PCR缓冲液PCR缓冲液是PCR扩增的一种重要因素，尤其是Mg2+，可影响反应的特异性和产率

4、。Taq DNA聚合酶具有Mg2+依赖性，因而PCR反应对Mg2+有较高要求。Mg2+浓度低时，Taq酶活性较低；一般认为在2.0mM时，Taq酶具有最大活性；更高浓度的Mg2+对Taq酶具有抑制作用。并且会导致反应特异性降低，一个不容忽视的问题就是Taq酶的活性增高会降低反应的特异性，因而市售的Taq酶一般都有现成的、含有Mg2+的缓冲液，一般为1.5mM。Mg2+本身又受到很多因素的影响，可与EDTA或其它螯合物结合。因此在使用高浓度的模板DNA或过量的dNTP时，要相应增加Mg2+浓度。现在又有一种新的观点，即退火温度越高，Mg2+浓度应相应增加，已有人将Mg2+浓度增至6mM。 PCR

5、循环参数.1 温度和变性 变性失败是最终导致PCR失败的一个常见原因 PCR反应循环开始，先进行变性，将双链模板变性解离为单链。温度是变性的条件，一般采用94，25分钟。而时间的长短则由模板和PCR仪来确定，如模板欠佳或GC含量过高，应相应延长时间。温度过高或时间过长会对Taq酶活性和dNTP造成损害。Taq酶可以在这时加入，也可以在最初加好之后进入PCR循环，即94变性1分钟，退火1分钟和72延伸1分钟，常规进行2535个循环。最后，进一步完善PCR反应，在72延伸10分钟。模板DNA的复杂程度决定了变性的温度和时间.2 温度和复性 引物长度在1525bp时，其退火温度 Tm=4(G+C)+

6、2(A+T) 可根据AT与GC的个数，从其交叉点迅速查出较为合适退火温度 寡核脱氧核苷酸的(Oligodeoxyribonucleotides)的Tm(CG) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25(AT) 3 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 4 59 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 5 56 59 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 6 53

7、 56 59 62 64 67 69 71 73 75 76 78 80 81 83 84 85 7 50 53 56 60 62 64 67 69 71 73 75 77 78 80 81 83 84 8 47 51 54 57 60 62 65 67 69 71 73 75 77 78 80 81 83 9 44 48 52 55 57 60 63 65 68 70 72 74 75 77 78 80 81 10 41 45 49 53 55 58 61 63 66 68 70 72 74 75 77 78 80 11 39 43 46 50 52 56 59 61 64 66 68 70

8、 72 74 75 77 78 12 40 44 48 51 54 57 60 62 64 66 69 71 72 74 75 77 13 42 46 49 52 55 58 60 63 65 67 69 71 72 74 75 14 43 47 50 53 56 59 61 63 65 67 69 71 73 74 15 44 48 51 54 57 59 61 64 66 68 70 71 73 16 45 49 52 55 57 60 62 64 66 68 70 72 17 47 50 53 56 58 61 63 65 67 69 70 18 48 51 54 57 59 61 63

9、 65 67 69 19 49 52 55 58 60 62 64 66 68 20 50 53 56 58 60 62 64 66 21 51 54 57 59 61 63 65 22 52 55 57 60 62 64 23 53 56 58 60 62 24 54 57 59 61 25 55 58 60.3 温度和延伸 延伸温度常定为72，此时Taq DNA聚合酶活性最高。延伸反应的时间，根据待扩增片段的长度确定。理论上讲，1kb以内的片段，延伸1分钟足够了2.2.3 PCR最适合条件的选择 提高PCR的灵敏度及特异性是PCR能否成功的关键提高特异性的关键是： 退火温度应尽可能高； 引

10、物浓度应尽可能低； 热启动(hot start)：在第一次DNA变性后加入Taq酶，以避免第一次循环前的引物错配所产生的非特异扩增和引物二联体2.2.4 PCR产物的分析方法1、琼脂糖凝胶电泳：判断扩增片段的存在及大小。2、点杂交：更适合于扩增产物为多条带时的测定。3、Southern 杂交：用于鉴定扩增产物的大小和特异性其检测敏感度可达10ng。4、酶切分析利用内切酶特有的酶切点这一特性，达到产物鉴定目的。5、PCR-ELISA 法：修饰一个引物5端，使其带有便于PCR产物固定的功能基团，而通过修饰另一引物5端使其具有便于酶联显色检测的功能基团，达到酶联显色。6、颜色互补分析法：用不同荧光染

11、料标记不同引物对的5端，PCR扩增有不同的染料，因此表现颜色互补而区分出来。7、PCR-HPLC（高压液相层析）法：PCR产物通过HPLC仪自动分析，78分钟即可显示并打印结果，HPLC可检出0.3ng的产物。8、直接检测法：PCR反应中加入EB，随产物增加，EB嵌入产物DNA中的量也增加，从而得出PCR产物的量。2.3 几种特殊类型的PCR在介绍了PCR的基本知识后，我们来熟悉一下几种特殊类型的PCR：2.3.1 锚定PCR常采用的PCR必须知道欲扩增DNA或RNA片段两侧的序列，而在大多数情况下对某些序列本身或其旁侧序列并不清楚，这无疑限制了PCR技术的广泛应用，“锚定PCR”可以帮助克服

12、序列未知或序列未全知带来的障碍使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA。 2.3.2 不对称PCR(asymmethic PCR) Gyllensten和Erlich改进了PCR方案。在扩增循环中引入不同引物浓度，由此得到单链DNA。一般采用501001比例的引物浓度，在最初1015个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA （single strand DNA，ssDNA）（图2-12-5）。分离此扩增产物中的ssDNA可用原引物或第三条内部引物直接测序。反向PCR (inverse PCR) 反向PCR的应

13、用则可以对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。选择已知序列内部没有切点的限制酶对此段DNA进行酶切，连接形成环状DNA分子，此时选择合适方向的与已知序列两末端互补的引物，经PCR后，可以得到未知序列的DNA片段（），用此方法建立基因组步移文库，在分子生物学研究上是非常有意义的。右图：反向PCR示意图2.3.4 多重PCR(multiplex PCR) 即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。如果基因的某一区段缺失，则相应的电泳图谱上这一区带就会消失。多重PCR反应和Southern 印迹一样可靠，但显然要简便得多。目前报道的多重PCR反应，最多可同时扩增12条区带2.

14、3.5 着色互补PCR(color complementation assay)荧光PCR的原理是用不同的荧光染料，如红色的罗丹明(6-carboxy-x-rhodamin, POX)和绿色荧光素(5-carboxyfluorescein，FAM)等分别标记于不同的寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA区段，反应完毕后，利用分子筛除去多余的引物。用紫外线照射扩增产物，就能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色，据此可以很快诊断是否某种基因缺失，或是发现某些感染的病毒等。荧光PCR可以进一步发展为PCR临床自动化诊断打下基础2.3.6 定量PCR定量PCR技术

15、是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。3 DNA测序技术制作物理图谱的过程是一个逐步精细的过程。第一步把每条染色体分成平均长度在400kb的长片段，每段克隆到一个YAC上，所有YAC克隆都按照其在染色体上的实际位置进行排序，我们就得到了一个能够覆盖整个染色体的YAC文库。 把每一个YAC克隆携带的染色体片段经部分酶切形成一系列有重叠区域的40kb左右的片段克隆到粘粒上，得到粘粒文库。每个粘粒上的染色体片段再经酶切形成4kb左右的片段克隆到测序专用的质粒载体上。测序质粒上携带的4kb的

16、片段就可以用现在常规测序的方法进行测序了。把所有质粒克隆的DNA片段序列读出，再按照各个片段在染色体上的实际位置进行排列，最后就可以得到染色体的全部核苷酸碱基对序列。染色体的DNA碱基序列是基因组物理图谱的最精细形式。3.1 常规DNA测序技术的基本原理所谓常规测序方法的基本特点有两个：第一，把待测序的DNA分子进行处理，得到每个只差1个核苷酸的一系列逐步缩短的DNA分子的混合物；第二，通过凝胶电泳把这些DNA分子分离开来，形成阶梯状排列的条带，然后逐个读出DNA的碱基序列。3.2 DNA测序方法在此介绍四种测序方法： 3.2.1 化学法测序得到长度只差一个碱基的DNA分子的方法主要有两种。一

17、种是用化学方法把待测序的DNA片段在每个碱基处切断一次。这是由 Maxam和Gilbert发明的方法。具体做法是把待测序的 DNA分子成单链分子，其5端用p进行放射性标记。然后把这些单链DNA分于分成4份，每份用一种化学试剂处理DNA片段，每种试剂可使DNA分子在一种碱基的5端的磷酸二酯键处发生断裂。例如，试剂一可使单链DNA分子在A碱基处断裂，试剂二可使单链DNA分子在T碱基处断裂，依此类推。把反应条件控制好，使每个DNA分子只发生一次断裂，这样，我们就得到4种反应产物，每种由在一种碱基处发生断裂形成的DNA片段组成。 把这4种反应产物用聚丙烯凝胶电泳进行分离，两个DNA片段只要相差1个碱基

18、，就可以在这种凝胶中被分成两个条带。电泳完成后，用X光胶片进行曝光，最后得到一张由不同条带组成的序列图。从这张图上就可以读出待测DNA片段的碱基序列。 5端的第一个碱基G读不出来，可以通过测定互补链的序列测出这个碱基3.2.2 酸法测序与测序的自动化另外一种得到长度只差一个碱基的DNA分子的方法是英国科学家桑格发明的，这种方法利用DNA聚合酶以待测序的DNA单链分子为模版合成互补的新链。在合成新链时，合成原料除了4种脱氧核糖核苷酸外还加入一种2和3位上的羟基都脱除的核苷酸。由于缺少3羟基，当这种核苷酸被结合到链上后，它的后面不能再结合其他核苷酸，链的合成就此终止。与化学法测序类似，我们可以准备

19、4种反应物，加入的核苷酸类似物分别携带A，G，C，T碱基，每种反应物里包含在一种碱基处终止链延伸的长短不同的DNA片段。这些DNA片段也要用放射性标记，经过凝胶电泳和放射自显影，得到DNA条带图谱，根据图谱可以读出DNA的碱基序列。 这种方法比化学法简单，条件易于控制。用4种不同的荧光化合物分别标记4种反应的产物，就可以做到把4种反应物混合在一起进行电泳，可以提高电泳分析的效率。这种方法利用现代精密仪器和机器人技术可以实现DNA测序的高度自动化。目前市场上已经有各种型号的DNA自动测序仪可供选购DNA自动测序结果举例3.2.3 单分子荧光测序单分子荧光测序是一种快速DNA测序法，这是利用单分子

20、操作技术直接读取DNA的碱基序列的方法，与传统的荧光测序法相比，这种方法可大大提高速度。用桑格测序方法现在每天可以解读上万个碱基序列，但是如果单分子荧光测序取得成功，它可以在两分钟内完成传统方法一天的工作。 单分于荧光测序的主要过程如下。第一步，取一条大约有5万个碱基那么长的单链DNA分子，把它的一端用化学方法连接在一个非常微小的塑料球上，DNA分子就会缠绕在塑料球上。第二步，在一张类似激光唱片的圆盘上铺一层很薄的液体薄膜，然后用激光光钳把塑料球放在这张光盘的液体膜上进行移动，DNA分子就会在后面被拖着展开，就好像一只船拖着一条绳子快速前进，把绳子拉展一样。第三步，让拉展的的DNA分子与一种核

21、酸外切酶结合。这种核酸外切酶可以和 DNA的游离的末端结合，然后逐个把DNA的碱基切割下来。第四步，用单分子光谱技术逐个识别并且读出碱基即达到了测序的目的。3.2.4 DNA芯片与杂交测序DNA芯片是一种通过杂交测定未知 DNA序列的新技术。在一个玻璃或硅片上合成大量的寡聚核苷酸片段，例如可以合成 8个碱基长的全部可能的寡聚核苷酸片段（ 465，536种）。这些探针一头固定在固体基质上，另外一端是游离的。它们在硅片上有规律地排列着，每个特定位置上探针的序列都是已知的。 假如有一个DNA片段需要测序，我们可以把它的单链形式用荧光进行标记，然后与硅片上的6万多种探针进行分子杂交，在荧光显微镜下观察

22、杂交结果。如果某个探针与持测DNA的某个部分的序列是完全互补的，待测DNA分子就被结合到硅片上，这个探针所在的位置就会发出荧光。这种包含大量的生物遗传信息的寡聚核着酸阵列就叫DNA芯片，也叫基因芯片。 DNA芯片的制备要利用微电子芯片生产中的光刻技术以及在位组合化学技术。DNA芯片的阅读要使用显微术，信息的解读要利用计算机技术。因此，DNA芯片是多学科交叉的产物。相关铰接：DNA芯片 4 荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization, FISH）4.1 FISH基本概念FISH是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置

23、的方法。由于FISH操作安全简便、观察分析容易、立体分辨率高和信号明亮清晰，而成为目前最常用的ISH手段之一，并通过改进形成一系列FISH技术。4.2 FISH技术的发展1987年，创建了染色体原位抑制杂交(CISS)法。Cherif用随机引物法来标记探针DNA，在亲和素化荧光素的基础上再加相应的生物素化抗亲和素抗体，通过增加亲和素的检测复合物的层数，使荧光信号不断扩大，从而明显地提高了检测灵敏度。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AAF)标记探针建立了双色FISH技术。Nederlof等用3种荧光素探测3种以上的靶位DNA序列，创建了多色FISH方法。Speicher和Ried等用

24、不同的荧光染料组合标记不同的染色体，经过计算机图像分析，可以显示人类24条染色体的FISH图像。Guan等运用染色体切割技术制备了人类染色体24个长臂及19个短臂的染色体臂涂染探针(chromosome arm painting probe，CAP)，弥补了整条染色体涂染探针不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位的缺点，创建了micro-FISH或反向染色体涂染（reverse chromosome painting）。染色体定向荧光原位杂交（chromosomg orientation and direction fluorescence in situ hybridization，COD

25、FISH）使FISH探针只能与中期染色体的一个单体沿着短臂长臂的方向杂交，为染色体倒位的检测提供了有效的方法。4.3 FISH技术的特点FISH技术的优点在于：探针稳定、操作安全、快速、特异性高；多色FISH可以在同一核中显示不同的颜色，从而同时检测两种或多种序列。目前已可用5种荧光素显示23种颜色来代表23对染色体，从而使核型分析直观简单； Fish也可用于间期细胞核内DNA的三维结构的显示；反向染色体涂染可以准确、客观地辨别新生染色体的来源；microarray和tissue array使得一次性检测几百个基因或几百个组织成为可能，加速了对检测的速度。已逐渐用于细胞遗传学、产前诊断、核组成

26、、基因定位、基因扩增和缺失的检测及肿瘤生物学等领域。4.4 FISH原理图4.5 FISH与放射性原位杂交的不同70年代流行的检测方式是放射性同位素原位杂交，其不足之处：1）不稳定； 2）高背景； 3）曝光时间长； 4）结果统计学处理繁琐。5）同位素的使用和处理。而于80年代兴起的FISH技术则有效避免了上述不足，与放射性原位杂交相比，FISH探针的标记物不同，检测方法也不尽相同。4.5.1 探针的标记物不同放射性原位杂交 ：放射性同位素 FISH： 生物素、地高辛等半抗原4.5.2 检测方法不同放射性原位杂交：放射自显影 FISH：荧光标记抗体与抗原结合后检测荧光信号4.6 FISH基本方法

27、1.样本制备用于FISH的样本可以来自于常规的血涂片、常规方法制备染色体玻片以及石蜡或冰冻切片等。为降低本底，杂交前可用RNA酶和蛋白酶消化处理标本，然后再将玻片在70%甲酰胺中热处理一定时间，使DNA变性，然后于冷无水乙醇中退火，风干备用。2.探针FISH探针包括双链DNA、单链DNA、RNA和合成的寡聚核苷酸探针。DNA探针可分为为四类：基因组探针。多用于区分种间染色体或染色体区域的基因组DNA序列；重复顺序探针。其目标顺序通常是染色体上不同部位的串联高度重复顺序，能够在某一条染色体的着丝粒区或异染色质区产生致密的杂交带；染色体文库探针（又称涂染探针）。通常是用流式细胞仪从染色体悬液中分离

28、分出染色体，或对分带中期染色体进行不同程度的微切割(microdissection)，再经分子克隆或PCR扩增制备染色体特异性探针，主要针对染色体或染色体特异区进行杂交,用于检测分裂细胞中的染色体结构畸变和标记染色体；单一序列探针，其片段一般比较长，必须插入到粘粒、噬菌体或酵母人工染色体（YAC）中进行扩增，主要用于单拷贝基因基因家族的检测定位。探针标记分为直接标记和间接标记。直接标记就是将荧光素直接与探针相连。间接标记法是先在探针上接一半抗原、再用能同半抗原特异结合的带荧光标记的蛋白对其进行检测。标记方法多用缺口平移、随机引物标记和PCR扩增法。RNA探针可通过体外转录法制备。如果是原位杂交

29、的探针，片段长度不应长于300nt，小片段探针可更有效地穿透组织，较长探针应做适当降解。3.杂交把变性后的探针加到处理后的玻片上, 37杂交1620, 杂交完成后必须将游离的探针充分洗去。凉干后加适量的抗褪色液。4.检测和显色 检测方法包括直接荧光法和间接免疫荧光法。如用荧光染料直接标记探针,可直接置于荧光显微镜下观察;若探针是用一个半抗原标记的, 则可通过间接免疫荧光法进行检测。用生物素标记的探针经常用FITC(绿荧光)、德克萨斯红或罗丹明(红荧光)标记的亲和素来显色观察, 也可通过生物素化抗亲和素抗体夹层逐级放大信号进行检测,玻片还常用碘化丙啶(propidiumiodide，PI)补染,

30、 以便在荧光显微镜下观察杂交信号的同时,能看到胞核及染色体结构。4.7 常用的FISH探针的种类4.7.1 单拷贝探针常用的单拷贝探针有：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段等。其主要应用在（a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证；（b）确定染色体微小缺失与重复；（c）染色体断裂点分析；（d）间期细胞染色体数目异常诊断等方面例：DNA片段的染色体定位 FISH检测染色体微小缺失 _ 4.7.2 简单重复序列探针简单重复序列探针(simple repetitive probes) 即异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)，其

31、靶序列为卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)，多位于染色体的着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。此探针信号强，易识别，杂交时间短。主要应用在(a) 标记染色体识别 (b) 染色体数目异常检测 (c) 间期细胞遗传学研究和临床诊断 等方面右图：着丝粒探针4.7.3 染色体描绘探针染色体描绘探针(chromosome painting probes)是针对整条染色体或染色体区带的特异性探针探针制备：染色体描绘探针的制备有以下三种途径：（1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent)细胞融合的产物；（2）流式细胞技术

32、分离整条染色体DNA，并以载体克隆、PCR扩增；（3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增；应用（1）染色体数目和结构异常分析； （2）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。右图：利用染色体描绘探针进行比对5 基因芯片基因芯片是生物芯片的一种，由分子生物学、微电子学和计算机科学等多种学科相互交融而形成的新技术。其为基因表达谱的研究、新基因的发现、基因突变的检测、DNA多态性的分析、基因组作图等的提供了有效的手段。随着人类基因组计划的实施与信息化的推动，基因芯片作为一种新技术诞生了，它的产生既是人类改善生存状况的需要，也是现代生物学技术快速、高效、经济的要求。

33、5.1 生物芯片生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。这是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。Microarray分析是一个有力的分子生物学技术，也是“政治技术”，它之所以强有力是因为它是许多人所渴望的但又尚未控制的技术，“Gene chip将提供整个生命期中预防疾病的一个路标”5.2 生物芯片的主要类型生物芯片类型繁多，常见的有基因芯片（DNA芯片）、蛋白质芯片，还有抗体芯片、受体芯片、酶芯片、细胞芯片、组织芯片、药物芯片、传感器芯片等。按照芯片上固定的DNA种类

34、不同.基因芯片可分为cDNA和寡核苷酸等芯片。按照用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等。5.3 基因芯片基因芯片(genechip)又称DNA芯片或DNA微阵列，以DNA分子杂交技术为基础，将许多已知的、特定的寡核苷酸或基因(cDNA)片段作为探针，有序地、高密度地排列在玻璃、硅片或尼龙膜等载体上，制成DNA微阵列(DNAmicroarray)，对待测样品DNA或由RNA通过RT-PCR扩增得到的cDNA进行荧光分子标记，并与芯片上的探针杂交，再经过激光共聚焦荧光扫描系统扫描，检测探针分子杂交信号强度，通过计算机系统对荧光信号综合分析获得样品中大量基因序列及表达的

35、信息。5.4 基因芯片的基本原理与经典的核酸分子杂交方法（southern 、northern）一致，应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。能在一个微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成大量的分子识别探针；在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析5.5 基因芯片的工作程序的合成基因芯片的样本来自于两个方面：其一是直接从组织细胞中分离纯化DNA，并对待测样本中的DNA进行特异扩增；其二是提纯RNA，并进行逆转录以及cDNA扩增。在DNA扩增的过程中需要完成样本的标记。目前样品标记常采用荧光标记法，也可用生物素或放射性同位素

36、。标记后的样品需要进行纯化，以减小荧光背景对杂交信号检测的影响。离片合成法（off-chip synthesis） pin dispensor在片/原位合成法（on-chip/in situ sythesis） photolithography piezoelectric technologies5.5.2 点样芯片点样机 点样步骤 _ 5.5.3 三种常见的基因芯片制备方法比较Criterion Photolithography Piezoelectric Microspotting1.Combinatorial Yes Yes Nosynthesis2.Ink-jetting No Yes

37、 No3.Surface printing No No Yes4.Masks needed Yes No No5.Sample trcking No No Yes6.Density(cm-2) 244000 10000 65007.Length restriction 20-25nt None None8.Arrary elements Oligos only Oligos & cDNAs Oligos & cDNAs9.Prototyping cost High Moderate Low10.Applications Gene expression, Gene expression, Gen

38、e expression,mut detection mut detection mut detection11.Commercial Affymetrix Incyte, Protogene,etc Synteni,etcvendors样品准备与杂交分子杂交反应 基因芯片的分子杂交与southern印迹的方法一致。由于探针是附着在基因芯片的表面，会干扰靶分子与探针的结合，因此需要相应地延长杂交时间或增加靶分子的浓度。杂交反应条件必须根据探针的长度、类型以及GC含量等调整杂交液的盐浓度、杂交温度以及时间。右图：RNA逆转录为cDNA后进行杂交杂交信号的处理检测分析 基因芯片的分子杂交信号的检测

39、和分析需要高灵敏度的检测系统阅读仪及其分析软件。根据成像原理的不同，阅读仪可分为激光共焦扫描和CCD两种。前者分辨率和灵敏度较高，可获取高质量的图像和数据，但扫描速度较慢，而且价格昂贵。后者的特点与之相反。目前常用的是激光共聚焦扫描仪。右图：激光共聚焦扫描仪、CCD成像原理以及杂交信号的计算机处理6 免疫组织化学技术6.1 基本概念免疫组织化学（immunohistochemistry）也称为免疫细胞化学（immunocytochemistry）,它是应用免疫学和组织化学的原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究。由Coons于1941年及其同事首创。随着分子生

40、物学理论与技术的发展，这一技术更多地用于在细胞、基因和其他生物大分子水平上同时原位显示基因及其表达产物。是基因功能分析中的常用手段之一。6.2 基本原理根据抗原与抗体之间结合的高度特异性，将免疫反应引入组织或细胞，对待测抗原或抗体进行原位的定性、定位或定量分析6.3 基本过程免疫组织化学的全过程包括：抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；标记抗体的制备；组织细胞标本的制备；免疫细胞化学反应及呈色反应；结果的观察与分析。6.4 基本技术6.4.1 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术在1950年由Coons等建立，利用抗原与抗体可发生特异性结合的原理，先将已知的

41、抗原或抗体标记上荧光素，进而再利用这种荧光抗体（或抗原）去检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。根据检测目的以及待检物的不同特点，免疫荧光细胞化学技术有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法等不同形式。（一）荧光抗体的制备常用的荧光素分子主要有异硫氰酸（fluorescein-5-isothiocyanate，FITC）、四乙基罗丹明（tetraethylrodamine B200，RB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate）、藻红蛋白（phycoerthrin，PE）等，它们在不同波长激发光的作用下可发出不同颜色的荧光。1异硫氰

42、酸荧光素标记抗体的制备（1）所需试剂及设备1）试剂：被纯化的过的单克隆抗体或多克隆抗体、FITC、pH 9-9.5的碳酸盐缓冲液（Na2CO3 4.3g、NaHCO3 8.6g溶入到终体积为500ml的蒸馏水中）、PBS缓冲液（pH7.2）、DMSO；2）材料与设备：透析袋、紫外分光光度计、Sephadex G25柱等。（2）操作步骤1）将纯化过的抗体放入透析袋中，在加有pH 9-9.5的碳酸盐缓冲液容器中4OC透析过夜，透析后抗体被转移到一小烧杯中备用。2）配制FITC-DMSO溶液：称取适量FITC，加入DMSO溶解，使FITC终浓度保持在1mg/ml左右。3）按照适当比例将FITC-DM

43、SO溶液逐滴加入到透析后的抗体溶液中。（通常，当IgG的浓度为1mg/ml时，给每ml抗体溶液中加入50g FITC；当IgG的浓度为510mg/ml时,FITC的加入量则降为25gml）。4）将上述标记物用PBS稀释至2.5ml，室温下避光搅拌2小时。5）用Sephadex G25柱除去游离荧光素分子，收集第一个PBS洗脱峰（荧光素蛋白结合峰），按照下式计算F/P值。 F/P2.87A495/A280-0.35A495,其中A495、A280分表代表495nm、280nm下的光吸收值, 适当的F/P值应在2-4之间。6）分装，4避光保存备用。2四乙基罗丹明标记抗体的制备（1）所需试剂与设备：

44、四乙基罗丹明（RB200）、无水丙醇、生理盐水、pH 99.5的碳酸盐缓冲液（同上）、透析袋和Sephadex G50柱等。（2）实验步骤1）称取1g RB200和2g PCl5（五氯化磷）于研钵中仔细研磨5分钟后加入10ml 无水乙醇不断搅拌5分钟，再用滤纸过滤上述溶液，所得滤液将被用于抗体标记。（注：RB200可在 PCl5的作用下转变成磺酰氯SO2Cl,后者在碱性条件下可与蛋白质的-氨基结合从而实现对抗体的标记。）2）取抗体（浓度一般在20mg/ml左右）适量，按照每毫升抗体各加入1ml生理盐水和碳酸盐缓冲液的比例稀释，然后逐滴加入0.1ml RB200溶液,边加边搅拌。3）0-4结合1

45、218小时，再用生理盐水透析57小时。4）经Sephadex G50柱层析，除去游离荧光素。5）分装，4避光保存备用。3藻红蛋白标记抗体的制备（1）所需试剂与设备：纯化过的抗体（2.5mg/ml）、纯化过的藻红蛋白、异双功能试剂（SPDPH和SMCC）：SPDP3-（2-pyridyldithio）propionic acid N-hydroxysuccinimide ester、SMCC succinimidyltrans-4-（N-maleimidylmethy）cyclohexane-1-carboxlate、（注：SPDP用甲醇配成1.3mg/ml浓度，SMCC用甲醇配成1.7mg/m

46、l浓度备用）、77mg/ml二硫苏糖醇（DTT）、0.1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺（N-ethy maleimide，NEM）、不含Ca2、Mg2的PBS、甲醇、DMSO、Sephadex G25柱和Sephacryl S-300柱等。（2）操作步骤1）取0.25ml保存在60(NH)4SO4中的PE（4mg/ml），经离心弃掉上清，并用0.25ml PBS重悬。2）将上述重悬的PE溶液在室温下用150ml PBS透析30分钟，期间换液两次。3）调整透析后的PE溶液浓度在1.4mg/ml（共约有0.7ml体积），加入16l SPDP，室温孵育23小时。4）取纯化的抗体1ml（2.5mg/ml

47、），加入20l SMCC溶液，室温孵育1小时，制备SMCC-抗体交联物。5）加入30l DTT溶液到第三步交联好的SPDPPE中，室温孵育30分钟。6）用Sephadex G25柱层析纯化SPDPPE和SMCC-抗体交联物。7）将纯化后的SPDP-PE和SMCC-抗体交联物混合，4振荡过夜。8）加入80l的0.1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺室温振荡孵育30分钟，终止反应。9）利用Sephacryl S-300柱层析分离纯化PE标记的抗体，用PBS洗脱，收集第一个洗脱峰。10）分装，4避光保存备用。4四甲基异硫氰酸罗丹明标记抗体的制备（1）所需试剂与设备：纯化过的抗体、四甲基异硫氰酸罗丹明、0.

48、01M PBS（pH 8.0）、DMSO、pH 9-9.5的碳酸盐缓冲液（同前）、透析袋、Bio-Gel P-6层析柱等。（2）操作步骤1）取10ml抗体（6mg/ml）入透析袋在pH 9-9.5的碳酸盐缓冲液中透析过夜，将透析后的抗体被转移自一小烧杯中。2）称取四甲基异硫氰酸罗丹明1mg，用DMSO溶解制成浓度为1mg/ml的溶液。3）取上述四甲基异硫氰酸罗丹明溶液300l逐滴加入到透析过的抗体溶液中，室温下避光搅拌2小时。4）Bio-Gel P-6层析柱，用PBS洗脱，收集先流出的红色结合物。5）分装，4避光保存备用。（二）免疫荧光细胞化学染色方法主要介绍直接法和间接法。1直接法（1）染色

49、：给经过固定的细胞或组织材料滴加稀释至染色效价的荧光标记抗体，在室温或37孵育30分钟，期间，切片应被放置在湿盒中。（2）洗片：首先倾倒掉存留的荧光抗体，然后用pH 7.2或pH 7.4的0.01M PBS洗涤两次，每次5分钟，最后再用蒸馏水洗去结晶盐。（3）用50缓冲（0.5M的磷酸盐缓冲液，pH 99.5）甘油封固玻片，镜检。2间接法常用的间接法主要有两种：双层法和夹心法。（1）双层法1）吸取经适当稀释的一抗加在经过固定的组织细胞切（涂、爬）片上，在染色用的湿盒中37孵育30分钟。2）用pH 7.2的0.01M PBS洗涤两次，每次5分钟，最后再用吸水纸洗去残留的液体。3）滴加荧光标记的二

50、抗，置于湿盒中37孵育30分钟，再用 PBS洗涤两次，每次5分钟，用吸水纸洗去残留的液体。4）缓冲甘油封固，镜检。（2）夹心法：是一种用未标记的抗原检测组织或细胞中的抗体的方法。1）滴加经适当稀释的特异性抗原于经过固定的组织细胞切（涂）片上，在染色用的湿盒中370C孵育30分钟。2）用pH 7.2的0.01M PBS洗涤两次，每次5分钟，最后再用吸水纸洗去残留的液体。3）滴加可与抗原结合的特异性荧光标记抗体，置于湿盒中370C孵育30分钟。4）同步骤。5）缓冲甘油封镜，镜检。（三）免疫荧光染色的检查 免疫荧光标记的组织细胞玻片可用荧光显微镜、激光共聚焦扫面显微镜等进行检测。6.4.2 免疫酶组

51、织化学技术免疫酶组织化学技术在1966年由NaKane等人首创，是最常用的免疫组织化学技术，借助于酶组织化学技术而非荧光标记来检测抗原的存在，由酶分解底物，产生有色的产物或一定电子密度的颗粒，进行分析。主要有酶标抗体法和非标记抗体酶法两种主要形式。（一）酶标抗体法1酶标抗体的制备 可用于抗体标记的酶一般应具有以下几点：酶催化的底物必须是特异性的，容易被显示，易于在光镜下或电镜下观察；用于免疫化学的酶要易于获得，便于商品化和标准化；在中性pH值时，酶应比较稳定，标记在抗体上的酶应在12年内活性不变；所形成的终产物沉淀必须稳定，不能从酶活性部位向周围组织弥散，从而影响组织学定位；酶与抗体的连接不能

52、影响抗体的活性；在被检测的细胞或组织中，不能存在于标记酶相同的内源性酶或作用相似的酶。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）等。 酶标抗体的制备与荧光素标记抗体的制备不同，它需借助偶联剂的作用将酶链接到抗体分子上。常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠、maleimide等。这些偶联剂与抗体的结合借助于共价键相互作用，因而是不可逆的，同时，偶联剂的加入还应不影响酶和抗体的活性，不会导致酶标抗体与细胞组织的其他成分发生非特异性结合。2染色方

53、法 酶标抗体的染色同样包括直接法和间接法两种，以间接法为主。间接法的染色程序主要包括以下步骤。（1）细胞组织切（涂、爬）片的准备与固定。（2）用PBS或其他缓冲液洗涤切片三次，每次2分钟，溶解除去冰冻切片上的OCT包埋剂。（但当应用ALP标记的抗体时，应禁用二甲胂酸钠缓冲液洗涤，因为后者可使ALP失活。石蜡切片在洗涤后直接进行第四步）。（3）根据需要，用甲醇0.3%过氧化氢处理切片1530分钟，封闭内源性氧化酶的作用，PBS洗涤两次，每次2分钟。（应用ALP标记的抗体时可省略此过程）。（4）在室温条件下，将切片放入到含0.05%Tween-20的PBS缓冲液中处理5分钟，以增强组织的通透性。（

54、5）用4的Block Ace或0.01%1%的BSA在适合中孵育切片1525分钟，以阻断抗体与组织的非特应性结合。（6）轻轻弃掉上述孵育液，根据需要滴加含0.2%BSA，0.05% NaN3的经PBS稀释的一抗。通常，每片滴加5080l，室温下湿盒中孵育12小时，免疫电镜标本需要在40C下过夜。（注：此处漂洗时应与对照组分开洗涤以防交叉污染）。（7）PBS洗涤三次，每次2分钟，以除去非特异性结合的吸附抗体。（8）用含0.05%Tween-20的PBS缓冲液洗涤2分钟后，滴加含0.2%BSA，1正常血清的经PBS稀释的HRP酶标二抗，室温下湿盒内孵育4560分钟。（9）PBS洗涤三次，每次2分钟

55、。（10）显色：HRP标记抗体的显色剂为含有0.01-0.1%H202、0.01-0.05%DAB、0.01-0.1M Tris-HCl（pH7.4）的缓冲液。切片经PBS漂洗后，在室温黑暗条件下置入上述显色液中显色，镜检控制显色时间与速度。（11）流水或PBS终止显色。（12）系列乙醇脱水、Hemo-De透明、DPX封固、镜检。（二）非标记抗体酶法非标记抗体酶法由Sternberger等在酶标法的基础上发展而成，能有效降低背景，能最大程度保留抗体的活性，灵敏度高。主要有酶桥法（enzyme bridge method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase antiperoxida

56、se method, PAP），又以后者的应用较为广泛。这两种方法均需先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后在第二抗体（亦称桥抗体）的作用下，将抗酶抗体与和组织抗原结合在一起的第一抗体连结起来，进而再将酶结合在抗酶抗体，最后经呈色反应来显示抗原的分布。所不同的是，在PAP法中，通常先让抗酶抗体与酶形成复合物（如PAP复合物），然后在桥抗体的帮助下，一次性将抗酶抗体、酶与一抗结合。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，同时还提高了方法的敏感性，且能节省第一抗体的用量。 PAP法过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxid

57、ase Antiperoxidase ,PAP) 原理与酶桥法相似 制备PAP复合物: 使抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物PAP复合物的特征 在抗原稍过量时,所有抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物 PAP复合物的形状相当稳定,不受抗原量的影响 PAP复合物中HRP/抗HRP抗体的比例为3:2,即由3个HRP分子与2个抗HRP抗体组成,呈五角形结构PAP法的评价 抗体活性高:非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性 灵敏度高:3个酶分子对应1个抗原 不适合免疫电镜 AP复合物分子量大 背景染色低假阳性及其处理1.组织细胞内色素: 如神经黑色素,可用AKP代替HRP2.假过氧化物酶活性:

58、如RBC内的血红素辅基,用甲醇-0.3%H2O2预处理15-20min(室温)3.内源性过氧化物酶活性: 如粒细胞、 HYPERLINK /search.asp?Field=Title&Keyword=巨噬细胞&ModuleName=bio t _blank 巨噬细胞等，用AKP代替HRP4.游离醛基: 与蛋白质(含IgG)非特异性结合,用白蛋白预孵育封闭之5.疏水键和离子键: Ig可通过疏水键和离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体非特异性结合,用正常血清(首选制备二抗的种属)于一抗前孵育封闭之6.天然抗体及不纯抗体: 增加一抗稀释度7.载体蛋白抗体: 制备半抗原的抗体时,使用了载体蛋白,用固相

59、吸收技术将载体蛋白抗体除去增加染色强度方法1.重复显色2.重复一抗3.双桥PAP法 ABC法生物素-抗生物素法原理 Avidin 卵白素，统称为抗生物素或亲和素 a basic glycoprotein，MW 68 Kd biotin 生物素，small water soluble vitamin （vitamin H），MW 24Kd， Avidin(卵白素)具有4个同biotin(生物素)亲和力极高（较抗原抗体高100万倍）的结合点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时它们都具有与其它示踪剂结合的能力。抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(Avidin Biotin-Peroxi

60、dase Complex technique,ABC技术)ABC法的评价1.敏感性强:亲和力强2.特异性强:一抗和二抗工作浓度低3.时间缩短4.多重标记 LSAB法链霉亲和素生物素法（Laballad Streptavidin Biotin Method，LSAB）是近年来在免疫病理诊断中采用的一种新方法。雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的检测，对指导 HYPERLINK /treatment/subject/cjb/fkcjb/ruxianai t _blank 乳腺癌的 HYPERLINK /focus/lc/ t _blank 临床治疗和预后判断具有重要意义。应用LSAB法进行ER