重组人胰岛素研究历史和生产工艺课件

1、 重组人胰岛素的研究历史 和生产工艺BY: 王腾 时佳 孙玉新 玛依努尔 据世界卫生组织统计，2011年全球糖尿病患者2.8亿，在中国，已突破9200万人，发病率达10%，同时由于老龄化等因素，国内还有9000多万的潜在糖尿病患者。加之中国糖尿病患者整体治疗率不足三成，且人均胰岛素使用量偏低，仅为美国糖尿病患者人均使用量的0.8%，所以中国胰岛素市场潜力巨大。 重组人胰岛素 胰岛素定义： 胰岛素是由胰岛细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 胰岛素结构： 胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个

2、氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。 3D Structure of Insulin胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer ）Ins的性质 胰岛素的功能 稳定性Ins在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳定还原剂及多种重金属使Ins失活 紫外线、光氧化、超声波会引起Ins变性。 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。1921年-从动物胰

3、腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。1926年-重结晶胰岛素1930s-传统中、长效动物胰岛素1970s-单峰胰岛素和 单组分胰岛素 70年代末-半合成胰岛素重组胰岛素的研究历史基因重组人胰岛素研 制成功 基因重组人胰岛素实验基因重组来源的胰岛素（27种）药品名称生产企业药品名称生产企业APIDRA SANOFI AVENTIS US LANTUS SANOFI AVENTIS US EXUBERA PFIZER LEVEMIR Novo Nordisk HUMALOG LILLY MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS HUMALOG MIX 50/50

4、LILLY NOVOLIN 70/30 Novo NordiskHUMALOG MIX 75/25 LILLY NOVOLIN L NOVO NORDISK INC HUMALOG PEN LILLYNOVOLIN N NOVO NORDISK INC HUMULIN 50/50 LILLY NOVOLIN R NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 LILLY NOVOLIN R（Purified）NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 PEN LILLYNOVOLOG NOVO NORDISK INC HUMULIN BR LILLYNOVOLO

5、G MIX 70/30 NOVO NORDISK INC HUMULIN L LILLYVELOSULIN BR NOVO NORDISK INC HUMULIN N LILLYVELOSULIN BR HUMANNOVO NORDISK INC HUMULIN R LILLYHUMULIN U LILLYHUMULIN R PEN LILLY胰岛素给药方式的发展注射给药非注射给药一种新的注射给药方式:NIS泵 通过一条与人体相连的软管向体内持续输注胰岛素的装置。它模拟人体健康胰腺分泌胰岛素的生理模式。俗称“人工胰腺”。 维持血液中INS水平 缩短控制高血糖的时间 减少低血糖发生， 减轻病人多

6、次皮下注射INS的痛苦 INS泵是强化治疗的最佳手段非注射给药口服给药：由于采用了包裹的方法来保护胰岛素制剂，口胰岛素在胃及小肠内不被破坏，在大肠内分解、释放出来，通过肠黏膜进行吸收。肺部给药：巨大的肺泡表面积、极薄的肺泡、丰富的毛细血管网、狭小的气血通路、低酶活性、肺深处较慢的清除速率等，这些良好的生理环境为蛋白多肽的吸收提供了有利条件。眼部给药：INS主要通过眼结膜和鼻泪管黏膜吸收进入体循环两达到降糖效果。一般眼内容量少，INS作用时间短，生物利用度低因此人们致力于研究能延长INS作用时间的滴眼剂，并选择刺激性小的滴眼剂。鼻腔给药黏膜内血管丰富黏膜上蛋白酶含量也比胃肠道中少，减少了INS被

7、酶破坏失活。提高了药物的生物利用度。许多药物动力学研究表明，鼻黏膜吸收INS的机制与体内内源性的INS释放极为相似，为鼻腔INS给药提供了理论依据。鼻腔给药需要加入吸收促进剂才能增加吸收效果口服给药、局部给药 人胰岛素分类传统中长效胰岛素 长效人胰岛素类似物速效人胰岛素类似物非注射胰岛素 Lispro （赖脯胰岛素 ，Humalog ）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。 Aspart（门冬胰岛素，Novolog ）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。APIDRA （赖谷胰岛

8、素，Apidra ）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。长效胰岛素-人胰岛素类似物1. 甘精胰岛素（ glargine ）： 商品名Lantus-甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两个精氨酸。使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结晶。2. Insulin Detemir：商品名Levemir -胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基 酸的14碳游离脂肪酸该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其

9、半衰期。 胰岛素肺部吸入制剂-Exubera辉瑞、万安特以及Nektar 共同研发于2006.1.27被FDA批准一种作用快的胰岛素干粉吸入剂适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征胰岛素制备工艺 以动物胰脏为原料提取胰岛素 -酸醇提取法 半合成胰岛素-以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产人胰岛素 AB链合成：分别表达AB链，化学方法连接 逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素Ins A链Ins B链转化大肠杆菌发酵A链B链纯化二硫键活性胰岛素AB链合成人胰岛素质粒Ins mRNA反转录Ins cDNA转化大肠杆菌PCR连接胰岛素原活性胰岛素二硫键酶切 提取质粒限

10、制性内切酶酶切 反转录酶法合成人胰岛素 离子换，分子筛色谱，反相色谱结晶CNBr裂解，去除保户多肽发酵胰岛素原融合蛋白胰岛素原（ SSO3 ）粗品亚硫基化胰岛素原纯化胰岛素原纯品酶切解离A,B链胰岛素粗品纯化的人胰岛素基因重组大肠杆菌生产重组人胰岛素工艺流程破碎菌体 包涵体 尿素溶解 复性酵母系统生产重组胰岛素优点：二硫键的结构与位置正确，不需要复性加工处理缺点：表达低，发酵时间长表达载体结构基因组成：信号肽、前肽序列、MCS 和微小胰岛素原。 前肽序列引导目的蛋白通过正确的分泌途径至胞外。宿主：贝克酵母。分泌量大，形成二硫键，培养基简单，高密度发酵，无热原和有毒物质发酵生产重组人胰岛素设备重组胰岛素的质量控制测定生物活性效价测定控制产品中杂质或潜在有害物质保证产品安全性和有效性长期重复大剂量使用通化东宝 1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖” 甘舒霖 R- 常规重组人胰岛素注射液 甘舒霖 N- 低精蛋白重组人胰岛素注射液 甘舒霖 30R- 30/70混合重组人胰岛素注射液 （ 30%常规重