低氧反应元件调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对新生血管的影响

1、低氧反响元件调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对新生血管的影响【摘要】目的讨论动物整体程度下低氧反响元件(HRE)调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对促生血管的影响。方法建立兔心肌缺血动物模型，实验分为转基因组、缺血对照组、载体对照组和假手术组。取缺血区心肌组织，检测心肌组织HIF-1和hVEGF165表达，应用D31及-SA免疫组化染色测定缺血心肌新生血管密度变化。结果心肌缺血早期，伴随内源性HIF-1表达增加，hVEGF165RNA及蛋白表达相继升高，缺血46周至顶峰(P0.01)，缺血12周，hVEGF165表达下调至缺血前程度。缺血12周，转基因组D31血管密度显著高于缺血

2、对照组(P0.01)；但是，与缺血前相比，缺血12周，转基因组-SA血管密度显著低于缺血前程度(P0.01)。结论HIF-1-HRE对缺血心肌转染hVEGF165表达发挥了有效的正相调控作用，有效地促进缺血心肌毛细血管生成。但hVEGF165作为促血管生成早期调节因子，其促生血管的构造尚不完好。【关键词】低氧反响元件；血管内皮生长因子；基因调控;心肌细胞;缺氧本课题组前期研究结果说明，在细胞程度，低氧反响元件HRE对缺血心肌转染hVEGF165基因表达发挥了良好的调控作用1-2。但是，在动物整体程度，HRE对缺血心肌转染hVEGF165基因长期调控行为对促血管再生的影响尚未说明，本研究旨在动物

3、整体程度，讨论在HRE调控下，缺血心肌转染hVEGF165基因表达对再生血管生成的影响，为进步缺血心脏hVEGF165基因治疗的有效性及平安性提供实验根据。1材料和方法1.1病毒包装及纯化pAAV-9H-hVEGF165由美国加利福尼亚大学Prf.Su惠赠。pAAV-Helper、pAAV-R由北京协和医院提供。病毒包装由本课题组前期工作完成1。将HEK293T细胞接种于9平板，10gpAAV-9H-hVEGF165、10gpAAV-R、15gpAAV-Helper、2.5l/Lal2100l与去离子水混合至500l，参加500l2HeBS，混匀后参加HEK293T细胞培养皿中，培养23天，将

4、细胞从培养皿上刮下、离心，参加80l/Lgl2的PBS至细胞密度为107个/l，参加DNA酶和RNA酶,离心，取上清参加粉剂PEG8000至终浓度10%；冰上置1h，离心，25l/LTris-HlpH8.0溶解沉淀。采用等体积氯仿抽提，离心，回收水相，-20保存、备用。1.2实验动物成年新西兰大耳白兔，雌雄不限，体重22.5kg，平均2.30.15kg，共147只。由徐州医学院实验动物中心提供。1.3实验方法1.3.1心肌缺血动物模型制备动物硫贲妥钠静脉麻醉，正中开胸，显露心脏。在左冠状动脉前降支上1/3交界处，6-0无损伤线缝扎，肉眼见结扎点下方左室前壁心肌渐变青紫、肿胀，同期监测EG出现典

5、型心肌缺血改变者，确认模型成功。1.3.2实验动物分组及处理实验动物随机分为4组。转基因组A组，n=42：模型动物，心脏缺血区域分4点注射40lrAAV-9HRE-hVEGF165。缺血对照组B组，n=42：模型动物，心脏缺血区分4点注射40l0.01l/LPBS。载体对照组组，n=42：模型动物，心脏缺血区分4点注射40l9HRE-LaZ。假手术组D组，n=21：正常动物，仅开胸，游离左冠状动脉，未结扎。4组动物分别于缺血前(0)及术后2、4、6、8、10、12周取材A、B、组每时间点6只，D组3只。麻醉后取动物心脏，取材组织分别采用液氮保存Realtie-RT-PR及estern-blt检

6、测及10%中性甲醛固定免疫组化。于缺血12周时点，另取A和B组肝脏组织，液氮保存，待estern-blt检测。1.3.3心肌低氧诱导因子HIF-1及hVEGF165RNA表达检测采用Real-tieRT-PR方法定量检测心肌组织HIF-1及hVEGF165DNA片段。HIF-1引物：HIF-1-FP，5-ATGAGATTAAGATA-3；HIF-1-RP，5-TGGTAGGTAGGTGAATTGT-3。hVEGF165引物，HIF-1-FP,5-TATAATGAAGTG-3；HIF-1-RP,5-GAGTAGTGGTGATAGAA-3。内参为-atin。取100g心肌组织，匀浆，离心，定量提取

7、RNA。取10l总RNA，6510in，离心15s，在相应试管中分别参加20lHIF-1反响体系或20lhVEGF165反响体系。完成PR循环。将标准曲线样品和待测样品参加同一块96孔板中，采用7300Real-tiePR仪美国AB公司定量检测HIF-1及hVEGF165DNA片段。1.3.4esternblt测定HIF-1、hVEGF165蛋白表达每组取100g心肌组织，Lry法测定蛋白浓度。采用蛋白免疫印迹法，10%SDS电泳，半干电转移30in。分别参加hVEGF165/HIF-1一抗(小鼠抗人VEGF165单克隆抗体，1250；小鼠抗兔HIF-1单克隆抗体，1300)，二抗为羊抗小鼠I

8、gG-AP1100)，NBT/BIP显色，所得显色条带图象扫描，半定量分析。1.3.5缺血心肌血管密度测定采用免疫组化SP法染色方法分别检测D31及-平滑肌肌动蛋白-sthusleatin,-SA表达。石蜡切片，胰蛋白酶消化抗原修复。0.03%TritnX-100处理切片10in，PBS冲洗，5%正常羊血清封闭；分别参加一抗小鼠抗兔D31抗体，150；小鼠抗兔-SA抗体，150)，4过夜；参加羊抗小鼠二抗1200，DAB显色。应用HIAS2000型图像分析系统武汉千屏影像公司，观察D31及-SA免疫组化染色阳性组织切片，以直径短径58血管为毛细血管、直径短径1550血管为微动脉血管，进展图象分

9、析，测定血管密度3。1.4统计学处理资料以s表示，采用单因素方差分析及q检验进展统计分析，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1缺血心肌HIF-1表达测定结果转基因组和缺血对照组缺血心肌均可见内源性HIF-1RNA表达，其表达呈先增后减趋势。缺血2周，HIF-1RNA表达至峰值，而后逐渐降低。缺血12周，转基因组HIF-1RNA表达显著低于缺血对照组(P0.01图1。转贴于论文联盟.ll.心肌梗死后，各组HIF-1蛋白表达上调，显著高于缺血前程度P0.01，缺血4周，HIF-1蛋白表达至峰值，此后HIF-1蛋白表达呈逐渐减少趋势。与缺血对照组比拟，缺血1012周，转基因组HIF-1表达显著

10、降低(P0.05图2。2.2缺血心肌hVEGF165表达测定结果转基因组可见hVEGF165RNA表达，其他各组均无表达。缺血4周，该组hVEGF165RNA表达至峰值P0.01；缺血12周，转基因组hVEGF165RNA表达显著降低，与缺血前程度比拟差异无统计学意义P0.05图3。心肌缺血后，转基因组可见hVEGF165蛋白表达，其他各组均未见其表达。缺血2周，转基因组hVEGF165蛋白表达明显高于其他各组(P0.01,缺血6周表达至顶峰P0.01，随后，hVEGF165蛋白表达程度逐渐降低图4。2.3D31+血管密度检测结果结果显示，缺血2周，转基因组、缺血对照及载体对照组D31+血管密

11、度显著低于缺血前程度。而后，转基因组D31+血管逐渐增加；缺血1012周，与缺血前程度及缺血对照及载体对照组各相应时点相比，转基因组D31+血管密度显著增加P0.01图5。2.4-SA+血管密度检测结果心肌缺血2周，各组-SA+血管密度均明显减少。缺血12周，转基因组-SA+血管密度显著低于缺血前程度P0.01，且与缺血对照组及载体对照组相应时点相比，差异无统计学意义图6。2.5转基因平安性检测结果estern-blt测定结果显示，转基因组心肌组织可见hVEGF165蛋白高程度表达，而该组肝脏组织，以及缺血对照组心肌和肝脏组织中均未检测出hVEGF165蛋白图7。3讨论促血管生成转基因治疗可通

12、过促进缺血组织血管新生，改善部分血供。研究显示，对于弥漫性缺血性心脏病而言，促血管生成转基因治疗具有良好的应用前景。血管内皮生长因子(VEGF)是一种低氧诱导性血管生长因子，具有氧相关性调控血管新生的作用。本课题组既往研究显示，将重组相关腺病毒(rAVV)携带hVEGF165基因转染缺血心肌中可产生明显的促血管生成作用2。HIF-1是由缺氧等因素诱导细胞产生的一种核蛋白。在病理条件下，低氧是活性HIF-1的主要诱导因素4-5。低氧可通过减缓其降解，增加HIF-1的稳定性及活性HIF-1含量，后者可与HRE结合而诱导其下游多种基因的表达。本课题组前期在细胞程度的研究显示，将rAVV-9H-hVE

13、GF165转染培养的心肌细胞，在变化的氧环境下，低氧相关性HIF-1表达可通过与HRE结合，有效地调控心肌细胞转染hVEGF165基因的表达1。本实验结果说明，在常氧状态下，兔内源性HIF-1表达程度极低，而在心肌缺氧早期，HIF-1表达迅速增加，通过与9HRE的结合，有效地调控转染hVEGF165的表达，随着后者促血管新生作用对缺血心肌部分血供的改善，在心肌缺血后期第612周，内源性HIF-1表达逐渐降低。分析HIF-1和hVEGF165两者变化的互相关系，不难看出，与缺血对照组相比，缺氧早期，随着HIF-1的高表达，基因转染组hVEGF165RNA及VEGF蛋白表达分别在4周及6周到达顶峰

14、，显然，该时间段是转染hVEGF165发挥作用的最正确时间窗，从应用角度，该结果对确定hVEGF165基因治疗的有效时间点以及总体时间提供了有益的实验根据。随着缺血时间的延长，缺血心肌血管再生及部分缺氧的改善，HIF-1表达降低，此间，在HRE的调控下，转染hVEGF165表达也随之下调。根据本研究结果，在动物整体程度，在缺血心肌变化的氧环境下，HIF-1-9HRE基因调控系统对hVEGF165产生了有效地正相调控作用，HRE作为hVEGF165的氧媒介基因“开关，具有良好的灵敏性。血管新生(angigenesis)，是指芽生微小血管生成后，逐渐形成毛细血管和小肌性血管的过程。缺血心肌血管密度

15、检测结果显示，缺血4周，转基因组心肌D31+血管密度显著增高，由于hVEGF165蛋白消失的滞后性及招募血管内皮细胞的积累6，12周缺血末，转基因组D31+血管密度仍处较高程度。分析显示，转基因组D31+血管密度变化与hVEGF165表达趋势相一致。本实验还发现，缺血对照组心肌D31+血管密度远低于转基因组，而载体对照组那么无促血管新生的作用，这也排除了内源性HIF-1表达及rAVV载体本身对缺血心肌血管生成结果的影响。血管密度检测结果还显示，心肌缺血后，各组-SA+血管密度显著减少并维持在较低程度，显然，严重缺血导致了兔心肌血管平滑肌细胞的损伤。缺血12周，与D31+血管密度变化趋势不同，转

16、基因组心肌-SA+血管密度远低于缺血前程度，且与缺血对照组比拟无差异。该结果说明，尽管hVEGF165可有效地促进D31血管内皮细胞增殖，但心肌-SA低程度表达的结果那么提示，hVEGF165所诱生的毛细血管缺乏成熟血管-SA阳性肌细胞。从组织学角度分析，hVEGF165作为早期促血管生成调节因子所促生的新生血管较幼稚，组织构造尚不完好。为此，根据本研究结果，应当指出，在缺血心肌血管再生应用研究中，除应用血管生成早期调节因子hVEGF165之外，结合应用晚期血管生成调节因子，如Ang-、EP等，促进新生血管构造的进一步重塑及成熟，对进步血管再生效果、改善缺血心脏功能具有重要的应用价值。本研究结

17、果还显示，转rAAV-9HRE-hVEGF165缺血心肌未见血管瘤形成，亦未在其肝脏组织检测出hVEGF165的表达。在本实验12周心肌缺血条件下，在动物整体程度，HRE作为hVEGF165的氧媒介基因“开关具有良好的平安性。尽管如此，由于实验观察时间的限制，HRE对缺血心肌转染外源性hVEGF165表达更长期的调控作用、对诱生血管功能的影响以及长期平安性，仍需进一步深化研究说明。【参考文献】1张中明,姜波,董红燕,等.低氧反响元件对低氧复氧状态下心肌细胞转染人血管内皮生长因子165基因表达的调控作用J.中华实验外科杂志,2022,22(12):1510-1512.2董红燕，姜波，张中明,等.HRE对缺氧复氧心肌细胞转染hVEGF165基因表达的调控J.中华实验外科杂志,2022，258：1095-1097.3PnRT,NgI,Lau,etal.Turirvesseldensityasapreditrfreurreneafterresetinfhepatellulararina:aprspetivestudyJ.Jlinnl,2002,20(7):1775-1785.4HenryTD,AnnexBH,kendallG