医学免疫学课件：第6章 放射免疫技术

1、第六章 放射免疫技术中山大学附属三院曹宝华临床免疫学检验 一、放射性核素 二、放射标记物制备及鉴定 三、放射性125I放射活性检测 四、放射性检测的防护 一、分析原理 第二节 放射免疫分析 二、实验方法及测定 一、分析原理 第三节 免疫放射分析 二、实验方法及测定 三、IRMA与RIA的比较 第四节 放射免疫技术的临床应用 思考题 小结第一节 放射性核素与 放射标记物的制备简介Radioimmunoassay，RIA；Immunoradiometric assay,IRMA始创于1959年，Yalow和Berson用放射性核素标记胰岛素； 1968年Mile和Hale创立了IRMA。将抗原抗体

2、反应的特异性与同位素测定技术的敏感性相结合的一项标记免疫分析技术。灵敏度高（达ng甚至pg水平），应用广泛。开创了体液微量物质定量分析的崭新领域，并为其他标记免疫分析的建立和发展奠定了基础。第一节 放射性核素与 放射标记物的制备一、放射性核素放射性核素：在自然条件下可发生自发性转化，由一种放射性核素转变为另一种放射性核素，并同时释放射线。此过程称为放射性衰变。放射性衰变可分为、三类。用于放免的、两大类分别用液体闪烁计数器和晶体闪烁计数器测定。 125I(最常用) 131I 3H 14C射线 （电离辐射弱，对标记物的免疫活性影响小） （电离辐射强）理化性 活 泼 差核素丰度* 90% 20% 半

3、衰期 约60天 8天 12.3年标记方法 简 单 复 杂标记设备 低 廉 昂 贵测量条件 简 单 复 杂 （晶体闪烁计数仪） （液体闪烁计数仪） 缺点： 125I取代H会改变原物质的化学结构，有可能影响原物质的免疫活性； 比较容易发生辐射损伤而使标记抗原变性。常用标记核素二、放射标记物制备及鉴定标记物：通过直接或间接的化学反应将示踪物质连接到被标记分子上所形成的化合物。制备高比放射性、高纯度和完整免疫活性的标记物是高质量放射免疫分析的重要条件。被标记物是抗原：高纯度；蛋白质抗原可直接标记，非蛋白质抗原或半抗原需修饰后再标记。被标记物是抗体：高亲和力、高特异性、高效价、 高纯度。 抗体的鉴定抗体

4、分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度用亲和常数Ka表示。单位为稀度单位（LM-1）， 表示需将1mol抗体稀释至多少升， 才能使抗原-抗体结合下降50%Ka值高（10912L/mol）有助于 提高灵敏度、精确度和准确度 亲合力高亲合力低亲和性特异性特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力交叉反应率：将反应的最大结合率抑制下降50%时特异性抗原与类似物的剂量（ED50）之比抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性 效价通常将一株抗血清作系列稀释后与标记抗原反应，计算不同稀释度时抗体结合标记抗原的百分率，绘制出抗体稀释度曲线。效价一般指结合50%标记抗原时，抗血清的稀释度。12

5、5I-标记物的制备标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基芳香环上的氢原子。 125I2或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应直接标记法使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体200l反应时间1-2分钟弱碱性反应条件 乳过氧化物酶（LPO）标记法：LPO催化H2O2释放活泼的新生态氧，后者使125I-活化成125I2/125I+而取代被标记物分子中暴露的酪氨酸残基苯环上的氢原子。 该法反应温和，可减少对被标记物免疫活性的损伤；酶活性有效期不长，

6、稀释后即可终止反应，易于控制被标记物上125I的数量。间接标记法间接标记法( bolton-Hunter 法)：预先将125I用Ch-T法标记琥珀酰胺酯（HPNSE），制成的125I 化脂（ bolton-Hunter 试剂）功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。 bolton-Hunter试剂125I-标记物的制备标记125I-标记物的制备 - 纯化凝胶层析法聚合、损伤物 标记蛋白游离125I如标记反应混合液过G50柱层析，定时/定量逐管收集层析洗脱液，合并标记物峰洗脱液，加入蛋白稳定剂后，分装低温保存。由于脱I-及自身辐射造成蛋白破坏形成碎片等，贮存一定时间后需重新

7、纯化。125I-标记物的鉴定标记物质量放射化学纯度免疫活性 比放射性 放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的 放射性占总放射性的百分率（AcCL3/ALB 沉淀所有蛋白，沉淀物放射性占待测样品总放射线的百分率）应大于95% 也是观察标记物脱碘程度的重要指标免疫活性标记物与抗原或抗体结合的能力标记物与过量抗体反应，与抗体 结合的标记物的放射性与加入标 记物的总放射线的百分比该值越大, 标记物免疫活性好， 应大于80% 比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度，也可理解为每分子被标记物所挂放射性原子数目单位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性高，会提高灵敏度，但过高将影响标记物免

8、疫活性，因为辐射自损伤大。计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法 ：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性 结果准，测定复杂125I-标记物的鉴定比放射性计算法 结果欠准，计算简便125I-标记物鉴定 自身置换曲线 反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少 若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫性，两条曲线平行标准曲线 反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量） 和剂量递增的标准抗原组成 标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗 原的增加而竞争抑制性减少 标准曲线与自身置换

9、曲线平行表明在相同的放射性结合水平上，与抗体结合的标准抗原和标记抗原的物质浓度完全相同计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算为nCi/ml) 计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量(ng/ml)以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng)比放射性自身置换法晶体闪烁计数仪包括了NaI闪烁 晶体、光电倍 增管以及计数器测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm) 计算参数cpmB/T (%)F/T (%)B/F (%)拟合注：T即是B与F的总和三、放射性125I放射活性检测四、放射性检测的防护放射卫生防

10、护标准包括：实验室选址、布局、必要的防护器材、放射性废弃物的处理、放射性表面污物的去除、个人防护等。第二节 放射免疫分析(RIA)一、放射免疫分析（RIA）基本原理原理：竞争性结合（competitive binding) Ag AgAb + Ab Ag* Ag*AbAg*和Ag有等同的与Ab结合能力(免疫活性相同）；Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。定量测定受检标本中的抗原Ag以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(BF)与Ag的量变存在着

11、函数关系剂量反应曲线 注：T即是B与F的总和二、放射免疫分析(RIA)实验方法及测定抗原抗体反应Ag*Ag反应条件体积温度时间pHAb(标准Ag/样品Ag)平衡非平衡一步法二步法分离结合、游离标记物双抗体沉淀法 PEG 沉淀法 PR 试剂法 固相分离法 分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响 反应平衡效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好经济 活性炭吸附法 将抗体或抗原结合在固相载体上，利用固相抗体或抗原分离B和F，简便、快速、适用于自动化分析等特点，已逐步取代传统的液相分离方法。 测定仪器: 晶体闪烁计数仪(射线, 131I 125I 57Cr) 液体闪烁计数仪(射线, 14C 3H 32P

12、) 射线不能直接测定,测定前要加液体闪烁剂 计数单位为探测器输出的电脉冲数,单位为 cpm(计数/分)或cps(计数/秒) counts per minute/second数据处理 每次测定均需要标准曲线 标准抗原的不同浓度为横坐标,以在测定中 得到的相应放射性强度为纵坐标作图 放射性强度可任选B或F或计算值B/F,B/(B+F) 用电脑进行数据处理，先输入各标准管的浓 度和cpm,选择处理曲线方法(如横坐标标准品浓度 常以对数log或ln值表示)，再输入各样品管cpm， 打印出样本测定值。数据处理总 结 操作： 加样温育沉淀离心放射性测定 一般需要数小时到72小时不等。 受检标本抗原含量较高

13、，抗血清的亲和 常数较大，可选择较高的温度(15-17) 进行较短时间的温育，反之应在低温 4作较长时间的温育，所形成的复合 物较牢固。1.任何一种分析均需按试剂盒的操作方法严格执行, 不要任意改动.因为每步都是作者优选实验条件而 确定的. 2.操作过程中需注意放射性防护的要求及放射性污 染和污物的妥善处理. 3.RIA分析的误差一般比生化分析大,影响因素比较多. 每个实验室均应建立常规的质量控制制度,如质控 测定,量器的校正,质控图的绘制,常规做双管,必要 时重测.与临床建立反馈信息联系等,才能保证测定 质量,减少误差,提高诊断率.总 结 注意事项第三节 免疫放射分析(IRMA)一、免疫放射

14、分析(IRMA)基本原理以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应, 用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA，操作也较RIA简单。 免疫放射分析(IRMA) Immunoradiometric assay, IRMA. 从放免分析的基础上发展起来的. 特点是用核素标记抗体直接结合受检 标本中抗原的非竞争性免疫结合反应. 通过固相免疫吸附剂作为B或F的分离 手段.免疫放射分析(IRMA) 属固相免疫标记测定,原理与ELISA极为相似. IRMA主要是标记物是核素及最后检测是放射 性量. ELISA的标记物是酶, 酶催化底物生成有色 产物,根据颜色反应程度定

15、性或定量. 无论单、双位点的IRMA,放射性量均与受检 抗原量呈正比.单位点 IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合的标记抗体并将其分离, 测定上清液的放射量 双位点 IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。 二、分离技术和数据处理分离结合、游离标记物固相分离法 将抗体或抗原结合在固相载体（如聚苯乙烯）上，利用固相抗体或抗原分离B和F，简便、快速、适用于自动化分析。固相分离技术的重点是包被，在聚苯乙烯吸附预包被的抗体或抗原后，需用牛血清白蛋白封闭

16、聚苯乙烯材料上未结合抗体或抗原的空白位点，防止在以后反应中发生非特异性吸附。数据处理用系列标准品绘制标准剂量反应曲线，将待测样品进行同样操作，可从剂量反应曲线查得待测样品浓度。在绘制剂量反应曲线时以获得较好的相关系数（绝对值接近1）为标准。三、 RIA与IRMA的比较放射免疫分析RIA 以放射性核素标记 抗原与反应系统中 未标记抗原竞争结 合特异性限量抗体 来测定待检样品中 抗原量，待测抗原 浓度与检测的信号 强度成反比。（特异性抗体限量）免疫放射分析IRMA 以过量标记抗体与 抗原非竞争结合， 采用固相免疫吸附 载体分离游离和结 合标记抗体，待测 抗原浓度与检测的 信号强度成正比。 （标记抗

17、体过量）IRMA与RIA比较可靠性：是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同，借助标准曲 线与样品稀释曲线是否平行来判断方法的可靠性。剂量-反应曲线：针对不同的标记免疫反应类型选择适合的数学模型 以使剂量-反应曲线有良好的相关性（r0.9900），有效剂量 值（ED25、ED50、ED75）应设在此曲线最高和最低浓度之间，并 有足够落差。高剂量钩状效应（HOOK效应）：当标本中被测物浓度超过 线性范围上限时，所得结果反而降低或呈阴性的现象。HOOK效 应可以通过选用高亲和力抗体或对此类标本进行稀释后测定以 改善或消除。HOOK效应常见于双位点IRMA。放射免疫技术的方法学评价第四节 放射免疫技术

18、的临床应用1.内分泌疾病的诊断:T3、T4、TSH、TG、TM、 妇科激素、生长激素、皮质醇、醛固酮、 甲旁素、睾酮、胰岛素、C肽、胃泌素、 前列腺素等等.2.传染性疾病及寄生虫疾病的诊断3.肿瘤相关抗原 CA199、CA125、PSA、SCC4.血液疾病的诊断:转铁蛋白、白介素、细胞因子5.血药浓度的检测:洋地黄、地高辛、吗啡临床应用优点: 测定项目广泛 所需的设备和试剂的费用比较低廉缺点: 放射性对人员和环境的危害 试剂盒的保存和效期相对短 操作人员需严格培训在一定时期内还会被实验室所采用,但是被ELISA、发光免疫及分子生物免疫所代替是大势所趋.应用前景1.125I 作为免疫分析标记物有哪些优势？2.制备125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？3.评价125I标记物质量的指标有哪些？4.放射免疫分析和免疫放射分析的测定原理各是什么？5.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？6.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？7.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？思考