生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮

1、生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮【摘要】建立了检测氯胺酮的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(ba-elisa)。实验最正确测定条件：抗原包被浓度为2.0g/l、氯胺酮单克隆抗体浓度为10.2g/l，生物素化羊抗小鼠igg(bitin-igg)和酶标链霉亲和素(sa-hrp)的最正确反响【关键词】氯胺酮；单克隆抗体；生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法keyrdsketaine；nlnalantibdy；itin-avidinediatedpetitiveenzye-linkediunsrbentassay1引言氯胺酮(ketaine)是苯环己哌啶的衍生物，属n-甲基-d-天门冬氨酸(

2、nda)受体拮抗剂，主要用于小手术、小儿检查或诊断操作时麻醉诱导及辅助麻醉1。氯胺酮具有一定的兴奋、致幻和依赖性，近年来，其滥用现象日益严重。检测氯胺酮方法主要是色谱法24。由于生物样品的基体复杂，前处理步骤繁琐，色谱方法不合适大量样品的现场检测。因此，建立一种快速、可靠和低本钱的氯胺酮检测方法具有重要意义。免疫分析具有特异性强、选择性好等优点，可对复杂体系中痕量物质进展快速灵敏检测，被广泛应用于生物学、医学等领域5。2022年，tan等首次报道了由美国negen公司制造的氯胺酮试剂盒6。本实验利用制备的氯胺酮单克隆抗体，采用生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法，检测人体血清和尿液样品中的氯胺

3、酮，具有高特异性和高灵敏度等特点。2实验部分2.1仪器与试剂genis酶标仪(澳大利亚tean公司)；生化培养箱(哈尔滨东联电子技术公司)；96孔酶标板(美国star公司)；牛血清白蛋白(bsa)，卵清蛋白(va)和3，3，5，5-四甲基联苯胺(tb，美国siga公司)；生物素化羊抗小鼠igg(bitin-igg)，酶标链霉亲和素(sa-hrp)和hrp标记羊抗小鼠igg(北京博奥森生物技术)；溴代乙酰溴(山东金城医药化工股份)；氯胺酮、去甲氯胺酮和可卡因(中国药品生物制品检定所)；吗啡(青海制药厂)；其它试剂均为国产分析纯，实验用水为重蒸的去离子水。2.2实验步骤参加500l溴代乙酰溴7，常

4、温搅拌5h。将所得溶液旋转蒸干，用磷酸盐缓冲溶液溶解残渣。将含有bsa的磷酸盐溶液缓慢加至上述溶液，搅拌过夜，冷冻枯燥即得氯胺酮全抗原(ketaine-bsa)。全抗原(ketaine-va)的合成方法与ketaine-bsa一样。屡次免疫小鼠后，取其脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0交融，获得氯胺酮杂交瘤细胞，经挑选和克隆化后，将稳定分泌氯胺酮单抗的杂交瘤细胞株进展冻存。实验时将其从液氮罐中取出传代培养，状态良好后注射入小鼠腹腔内，两周后搜集腹水。采用优球蛋白法纯化所得腹水，用紫外-可见分光光度法测定，以公式prtein(g/l)=1.45a2800.74a260计算纯化后氯胺酮单克隆抗体的蛋白浓

5、度9，于20保存。参加氯胺酮单克隆抗体和氯胺酮溶液温育1h。再依次参加bitin-igg和sa-hrp，分别温育60和50in。然后参加底物，15in后终止显色反响。最后利用酶标仪测定450n的吸光度值。高、中、低浓度的氯胺酮参加上述血清和尿液样品中，同氯胺酮单克隆抗体混合，在优化条件下，采用ba-elisa法测定。3结果与讨论3.1全抗原的合成利用溴代乙酰溴对氯胺酮的仲氨基进展活化，活化后与bsa或va的氨基进展反响，获得氯胺酮全抗原(ketaine-bsa或ketaine-va)。以考马斯亮蓝法分别对ketaine-bsa和ketaine-va的偶联率进展测定，图1杂交瘤细胞染色体照片放大

6、600倍略fig.1phtsfsatihrsesfhybridas(agnifiatin600)结果分别为120和121，满足免疫反响的需求。3.2单克隆抗体的鉴定对处于生长对数期的杂交瘤细胞进展染色体检测。如图1所示，杂交瘤细胞约有100条染色体，证明其为小鼠脾细胞20对染色体与sp2/0细胞36对染色体交融而成。采用间接elisa测定腹水效价，结果为1105。3.3抗原和抗体工作浓度确实定分别以8，4，2和1g/l的全抗原包被酶标板，参加如图2所示，其中，0为抗体储藏液的浓度，为10倍比稀释抗体的浓度。本实验选择2.0g/l作为抗原的最正确包被浓度，在此抗原浓度下，吸光度下降到最大值一半时

7、的抗体稀释度为1000，所对应的抗体工作浓度为10.2g/l。图2抗原和抗体最正确工作浓度的测定略fig.2deterinatinftheptialnentratinsfantibdyandatedantigen3.4bitin-igg与sa-hrp反响条件的优化在bitin-igg不同的稀释度下，2倍比稀释sa-hrp，作吸光度与bitin-igg和sa-hrp稀释度的关系图(图3)，其中，0为sa-hrp储藏液浓度2g/l，为2倍比稀释sa-hrp浓度。再将不同稀释倍数的bitin-igg与sa-hrp反响的时间作图图4，在50in后，反响均到达平衡，考虑到吸光度的大小及反响的完全性对分析

8、结果的影响。实验的最正确条件：bitin-igg的稀释度为3500倍(0.29g/l)，sa-hrp的浓度为1.0g/l，与sa-hrp的反响时间50in。图3不同稀释倍数bitin-igg与sa-hrp2倍比稀释反响曲线图略fig.3t-tieserialdilutinurvefstreptravidin-hrseradishperxide(sa-hrp)inbitin-avidinediatedpetitiveenzye-linkediunsrbentassay(ba-elisa)ithpriarynentratinf2g/latdifferentdilutinsfbitin-lgg0：s

9、a-hrp2g/l，：2倍比稀释sa-hrpt-tieserialdilutin；ketaine-bsa：2g/l；抗体(ntibdy)：10.2g/l；bitin-igg：13500，()15000，()17000diluted(起始浓度(priarynentratin)：1000g/l。图4不同稀释倍数的bitin-igg与sa-hrp反响的时间关系图略fig.4tieurvesfseriallydilutedbitin-lggreatingithsa-hrpinelisaketaine-bsa：2g/l；抗体(antibdy)：10.2g/l；bitin-lgg：13500，()1500

10、0and()17000diluted起始浓度(priarynentratin):1000g/l。3.5方法的线性范围和检出限以lg(0/)为横坐标(0和分别为氯胺酮的储藏液和工作溶液浓度)、吸光度值a为纵坐标进展线性拟合。当氯胺酮的浓度在0.11000g/l的范围时，线性回归方程为a=0.1844+0.0298lg(0/)，r=0.9956。检出限为0.03g/ls/n=3。3.6方法的重现性与特异性对5批样品进展5次重复测定，批内和批间的rsd分别为1.61%3.10%和3.62%8.33%。以去甲氯胺酮、吗啡和可卡因为穿插反响物，采用50%替代法测定本方法的特异性。从表1中可知，吗啡和可卡

11、因的穿插反响率均小于1%；去甲氯胺酮约为10%，说明本方法的特异性良好。3.7氯胺酮生物样品的测定取冰冻安康人血清和尿液样品，分别参加0.9，9和90g/l的氯胺酮，测定结果见表2。回收率在94%102%之间，rsd为1.31%8.46%。表1抗体与氯胺酮、去甲氯胺酮、可卡因和吗啡的穿插反响率略table1rss-reatinfketaine，nrketaine，rphineandaine表2氯胺酮在血清和尿液样品中的回收率略table2reveryfketaineintheseruandurinesaples：ean3.8酶标二抗elisa法测定氯胺酮以某公司消费的氯胺酮单克隆抗体为对照，采用酶标二抗体系elisa方法对氯胺酮进展测定。其工作曲线方程为a=0.1304+0.0716lg(0/)(0和分别为氯胺酮储藏液和工作溶液浓度，r=0.9936，n=5)，线性范围为110000g/l，检出限为0.18g/l(s/n=3)。由于生物素-亲和素之间的结合力极强(亲和常数高达1015l/l)，且一个亲合素分子上可以标记多个酶分子，因此采用放大体系可以进步elisa的灵敏度10。实验结果