《球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法》编制说明

1、球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法标准方法编制说明书工作简况项目来源根据CSTM标准委员会2022年6月6日材试标字【2022】089号文件签发的关于CSTM标准的立项公告，批准CSTM标准球形蛋白质表观分子量的核磁共振检测方法立项，中文版立项编号为：CSTM LX 9802 00956-2022，英文版立项编号为：CSTM LX 9802 00956-2022 E，标准项目由科学试验领域委员会（CSTM/FC98）或技术委员会（CSTM/FC98/TC02）归口，由北京大学分析测试中心负责牵头起草。参与单位及工作组成员主编单位及成员：北京大学分析测试中心，李红卫博士和扶晖博士。协作单位

2、及成员：清华大学蛋白质研究技术中心，徐宁博士；深圳湾实验室公共技术服务平台，吴宇杰博士；布鲁克（北京）科技有限公司，吕娟工程师。工作简要过程2022年3月2日，北京大学分析测试中心在征求了多个协作单位同意的情况下，决定牵头组织制定球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法的标准方法。协作单位同意由北京大学分析测试中心负责方法的申请工作。2022年3月7日，北京大学分析测试中心完成了标准草案的预审稿和项目建议书等文件，北京大学分析测试中心老师以及各个协作单位的老师都提出了宝贵的建议。2022年4月29日，立项答辩前夕，北京大学分析测试中心专门召开CSTM标准制定的工作会议。李红卫老师进行了立项答辩

3、的试讲，中心其它老师提出了修改意见。2022年5月6日，在CSTM标准委员会的组织下，李红卫代表北京大学分析测试中心完成了球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法的标准方法的立项答辩。答辩过程中各个专家给出了修改建议。2022年6月6日，CSTM委员会签发了正式的立项公告。2022年5月6日，完成立项答辩后，由北京大学分析测试中心、清华大学蛋白质研究技术中心、深圳湾实验室公共技术服务平台等单位成员成立了标准编写工作组，建立了微信工作群，并进行了第一次工作组线上会议，正式开始了标准方法的编写工作。会上北京大学分析测试中心通报了项目立项情况，工作组确定了标准制定方案和时间安排，并进行了工作划分。北

4、京大学分析测试中心负责标准方法理论文献和标准制定的调研工作，完成球形蛋白质-表观分子量测定-核磁共振方法标准草案和标准编制说明的起草工作，并负责设计试验方案和汇总整理试验结果等工作。清华大学蛋白质研究技术中心和深圳湾实验室公共技术服务平台负责设计和完成方法准确性验证试验及方法准确度的相关工作。布鲁克（北京）科技有限公司负责试验仪器软硬件保障及相关试验参数校验等工作。2022年5月23日标准编写工作组线上召开了第二次会议，对北京大学分析测试中心提供的标准草案进行了讨论和修改，进一步完善了标准草案，并确定了测试试验与验证试验的试验方案与试验参数。2022年6月30日、7月7日和7月8日，北京大学分

5、析测试中心、清华大学蛋白质研究技术中心和深圳湾实验室公共技术服务平台分别完成了测试实验和验证实验数据的采集与处理。2022年7月15日北京大学分析测试中心完成了光散射验证数据的采集与处理。2022年7月18日北京大学分析测试中心完成了数据的汇总与精密度分析，并进行标准草案的完善和标准编制说明草案的编写。2022年7月21日，标准工作组召开第三次线上工作会议，对北京大学分析测试中心提供的标准草案和标准编制说明草案进行了讨论和修改，形成了标准的征求意见稿。本标准主要起草人：李红卫，扶晖，徐宁，吴宇杰，吕娟。标准化对象简要情况及制订标准的原则标准化对象简要情况蛋白质溶液体系中的表观分子量更加真实的反

6、映了蛋白质在接近生理状态下的聚集状态，而该聚集状态与许多蛋白质的功能直接相关，也是导致一些疾病的直接原因。核磁共振脉冲梯度场扩散序谱实验可以测定溶液体系中化合物的扩散系数，进而得到分子在溶液条件下的表观分子量，从而研究分子在溶液中的聚集状态。对于蛋白质来说，其研究多在缓冲体系中完成，蛋白质的缓冲体系多种多样，缓冲体系的不同直接影响溶液的粘度从而导致蛋白质分子扩散系数发生改变，得到的表观分子量也不同。并且由于蛋白质分子量较大，蛋白质浓度不同也将改变溶液的粘度，引起扩散系数改变从而影响表观分子量的测定。并且在实际测定过程中，不同的仪器脉冲梯度场强度也存在一些误差，而此误差将会以平方的形式放大作用于

7、拟合的扩散系数，从而导致测定结果的差别。因此在不同的测试条件下得到可比的数据是非常困难的。标准制定的必要性在不同测试条件下测得的表观分子量不能直接进行比较，大大降低了已测定的表观分子量在不同蛋白质体系中的应用价值。因此建立一套标准的测试方法，使得不同实验室、不同仪器和不同样品条件测定的结果具有可比性可以提高数据结果的使用率，提高测试效率。并且，蛋白质表观分子量与蛋白质的功能息息相关，建立一套标准的测试方法在蛋白质的功能研究，以及蛋白质类药物的研发和生产过程中的质量控制中均有较好的应用前景。制订标准的原则2.3.1 标准的编写格式按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准的结构

8、和编写规则、GB/T 20001.4 标准编写规则 第4部分：试验方法标准的统一规定和要求的统一规定和要求进行编写。2.3.2 本标准以建议一套在不同实验条件下结果具有普适性的标准化球形蛋白质表观分子量的测定方法为原则。方法中通过加入内标，以核磁共振测定相对扩散系数代替扩散系数进行表观分子量的测定，有效降低了测定条件对实验结果的影响，使得即使不同实验室的结果依然具有可比性，这是现有的方法无法实现的。2.3.3 本标准以北京大学分析测试中心李红卫博士2018发表的新方法的论文为基础，旨在探索一条针对“高精尖”仪器设备新技术方法“实验室研发-实验室应用-形成标准方法-广泛工业应用”的科技成果转化途

9、径。此类设备对操作人员技术水平要求较高，更多的时候是使用已经具有的技术方法为科学研究提供服务。针对此类设备新技术的开发对操作人员技术水平要求更高，更加难以实现，而研发新方法后再进行科技成果转化的更少。采用国内外先进标准情况本标准为创新方法，在制定过程中未采用国际标准和国外先进标准。标准主要内容确定的论据概述标准起草人对国内外检测蛋白质表观分子量的检测技术以及应用环境进行了调研，目前还没有发现能够测定蛋白质表观分子量的标准，而蛋白质表观分子量更加真实的反映了蛋白质在接近生理状态下的聚集状态，该聚集状态与许多蛋白质的功能直接相关，也是导致一些疾病的直接原因，在科研与医药行业具有广泛的应用前景。在解

10、决了不同测试环境影响下，核磁共振技术是测定蛋白质在各种体系下表观分子量最有效的手段之一。因此标准起草人编制了球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法标准方法草案，主要包括范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理和精密度等内容。标准名称本标准在立项时的名称为球形蛋白质表观分子量的核磁共振检测方法，根据立项时专家的建议，在编制过程中标准编写工作组决定采用符合GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则要求的三段式写法，将标准名称变更为球形蛋白质-表观分子量检测-核磁共振方法，相应的英文名称并更为Globular Prot

11、ein - Determination of Apparent Molecular Weight - NMR Method。范围关于测定对象的分子形状：实际使用过程中球形和近球形的蛋白质分子均适用于本标准的方法，大多数的蛋白质均满足这两种情况，包括对重组的蛋白质类药物、抗体药物以及其它用于科研的具有特殊功能的蛋白质分子的检测。此方法也可以应用于非球形蛋白质的研究，通过对比测定表观分子量和本身分子量，可以得出非球形蛋白质分子性质偏离球形的程度。关于检测对象分子量：分子量超过100kDa时，蛋白质的核磁信号较弱，测定结果误差会变大，故限定为100kDa以下的蛋白质。如果信号强度足够，100kDa的

12、限定是可以突破的。关于检测对象浓度：标准中使用的内标和蛋白质分子分子量差别较大，体系属于复杂体系，复杂体系在较稀情况下，粘度对两类分子影响差别不大（见标准原理部分），因此给出了浓度限制，实际上，平时用来测试的蛋白质浓度极少会用到1mM以上的浓度，因此绝大多少样品满足此条件。关于蛋白质的缓冲体系：缓冲体系中可以不同，这也是这个方法的优势，但是最好不要有更大的分子添加剂，因此更大分子的添加剂会增大粘度对两类分子的粘度影响（见标准原理部分），实际上常规测试样品是极少有大分子添加剂的，因为添加剂会产生信号干扰。原理 几乎所有的关于核磁共振测定扩散系数进而测定分子量、分子形状相关的文献都是从Stokes

13、Einstein方程开始，即核磁共振测得的扩散系数通过该方程与分分子形状进而与分子量相关。最初在编写标准时原理也是从这方面开始的。但是立项时专家提出如果同时考虑内标小分子和蛋白质大分子的复杂体系，StokesEinstein方程可能需要修正，由于目前该方法还比较新，建议夯实基础。标准编写组觉得这是非常好的建议，进一步更深层次的调研了这方面的文献，整理后加入了原理部分，使得原理部分更加详实。仪器、参数及数据拟合 考虑到蛋白质大分子信号较弱，所以需要采用高场超低温探头来进行实验。蛋白质大分子的样品都是在水的缓冲体系中检测，相对与水的信号，蛋白质的分子的信号是非常非常弱的，所以水峰压制应格外重视，如

14、应有好的匀场，准确的水的化学位移中心以及准确刻度的脉冲时间等。由于最终是通过强度的拟合得到扩散系数，所以谱图应保证有足够的信噪比，同时数据处理时要仔细调信号相位和基线。拟合使用的是e指数拟合，最强的信号和最弱的信号在保证信噪比的情况下，要到拟合曲线两端的平台区，否则拟合会有误差，经过工作组的多次实践，当最强信号和最弱信号强度比2030倍时最佳，所以需要对扩散时间和梯度场时间进行优化。精密度和不确定度目前并没有测定表观分子量的标准方法，关于精密度的计算并没有可用的参考。编写工作组根据该方法实际使用的场景，经过讨论，认为同一样品在不同的实验条件下的相对标准偏差小于10%，就能很好的满足实际使用的需

15、求。实际试验过程中，由北京大学分析测试中心、清华大学蛋白质研究技术中心以及深圳湾实验室公共技术平台对同一实验不同核磁共振仪器以及不同实验室的核磁共振仪器条件下进行验证试验，结果显示，无论同一实验室的不同仪器还是不同实验室的仪器，实际测定结果的相对标准偏差均小于5%。考虑到本标准的方法还比较新，立项时专家提出的使用更多的方法如质谱进行对比的问题，经过工作组的调研，质谱直接测定的是分子的绝对分子量和我们所提出的考虑溶液条件下的表观分子量还是有些出入的，但如果验证实验中采用的蛋白质在溶液中是以稳定的单体形式存在，则绝对分子量和表观分子量是比较接近的，这种情况下质谱可以进行试验方法的验证。工作组选择了

16、满足以上条件的标准蛋白，并且此标准蛋白出厂时已经进行了质谱分子量的测定，故工作组认为可以直接使用标注分子量验证，无需再重复进行质谱试验，结果显示标注分子量与核磁共振结果平均值的标准偏差为1.1%。另外，光散射可以测定特定溶液条件下的表观分子量，使用光散射的方法测定的表观分子量与核磁共振测定结果的平均值的标准偏差为4.4%。不同的试验手段都验证了核磁共振测定表观分子量的可靠性。主要试验（或验证）结果的分析、综述报告等 试验结果包括核磁共振仪器试验结果和其它手段试验结果。前者包括同一实验室、不同核磁共振仪器的试验结果和不同实验室、不同仪器的试验结果，这些结果用于验证不同仪器和不同操作人结果的重复性

17、。同时测定时每个样品分别在三种不同的缓冲体系下进行，测定结果用于验证缓冲体系中不同盐离子浓度和不同粘度对测定结果的影响。这些实验结果都具有较好的重复性。其它的实验结果包括了标注分子量（质谱结果）和光散射结果与核磁共振试验结果的对比，用于验证核磁共振试验方法的可靠性。结果显示核磁共振方法具有较好的可靠性。具体结果见本标准精密度部分，使用参数及拟合曲线等见标准附录部分。与有关的现行的方针、政策、法律、法规和强制性标准的关系本标准符合现行方针、政策、法律、法规的规定。现行的JY/T 0578-2020,超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱测试方法通则标准中界定术语和定义适用于本标准。对征求意见及重大分歧意见的处理经过和依据（暂无）标准水平建议，预期的社会经济效果本标准建立了一套使用核磁共振技术测定球形或近球形蛋白质表观分子量的标准