生物化学A（上）7-蛋白质化学5-结构与功能及研究方法

1、蛋白质的结构与功能为什么研究蛋白质的结构与功能对蛋白质结构和作用机理的深层次理解对蛋白质结构进行改造的基础对蛋白质功能的控制“随心所欲”创造具有新功能的蛋白质蛋白质的一级结构与其构象及功能的关系蛋白质一级结构是空间结构的基础，特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持，可根据一级结构的特点自然折叠和盘曲，形成一定的空间构象。 蛋白质的一级结构中，参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基，即使在整个分子中发生一个残基的异常，那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响。被称之为“分子病”的镰刀状红细胞性贫血仅仅是574个氨基酸残基中，一个氨基酸残基(亚基N端的第6号G

2、lu残基)发生了变异所造成的，这种变异来源于基因上遗传信息的突变。蛋白质的一级结构与功能的关系由较短肽链组成的蛋白质一级结构，其结构不同，生物功能也不同.由较长肽链组成的蛋白质一级结构中，其中“关键”部分结构相同，其功能也相同；“关键”部分改变，其功能也随之改变。一级结构是空间构象的基础 蛋白质一级结构决定空间构象，即一级结构是高级结构形成的基础。只有具有高级结构的蛋白质才能表现生物学功能。实际上很多蛋白质的一级结构并不是决定蛋白质空间构象的惟一因素。除一级结构、溶液环境外，大多数蛋白质的正确折叠还需要其他分子的帮助。这些参与新生肽折叠的分子，一类是分子伴侣，另一类是折叠酶。一级结构是功能的基

3、础 一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象和功能也相似。相似的一级结构具有相似的功能，不同的结构具有不同的功能，即一级结构决定生物学功能。蛋白质一级结构的种属差异与分子进化 从蛋白质氨基酸的序列可以了解到重要的生物进化信息。对于不同种属来源的同种蛋白质进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异。蛋白质一定的结构执行一定的功能，功能不同的蛋白质总是有不同的序列。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生变化。蛋白质的一级结构与分子病 蛋白质的氨基酸序列改变可以引起疾病，人类有很多种分子病已被查明是某种蛋白质缺乏或异常。这些缺损的蛋白质可能仅仅有一个氨基酸异常-分子病。同源蛋白质(不同生物中行使相同或相似

4、功能的蛋白质）一级结构的种属差异性 细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含Fe的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明： （1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性（相似性）越大。 不同生物与人的细胞色素C相比较，AA差异数目 黑猩猩 0 鸡、火鸡 13 牛猪羊 10 海龟 15 狗驴 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 44 （2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变。肌红蛋白的结构与功能（1）肌红蛋白的功能：哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。（2）肌红蛋白的结构特点（1963年，Ken

5、drew）： a .一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600。 b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。 c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。肌红蛋白的结构血红素（铁卟啉 ）辅基的结构及其氧合部位肌红蛋白的氧合曲线 Y=Mbo2Mbo2+Mb(Y代表在给定的氧压下肌红蛋白的氧饱和度) Y=PO2K+PO2（1）（2）由（1）可见：Y=1时，表明所有肌红蛋

6、白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白为氧饱和。由（2）可见： Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K 解离常数为肌红蛋白一半被饱和时的氧压。Po2Y1.00.510 20 30 40 50血红蛋白的结构、功能及镰刀形贫血病（1）血红蛋白的功能：存在动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH。（2）血红蛋白的结构特点：a. 四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000；b. 成人的血红蛋白为22；c. 链由141 AA残基组成， 链由146 AA残基组成。 四个肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。血红蛋白含有四条

7、肽链，每一条肽链各与一个血红素相连接。血红素同肽链的连接是血红素的Fe原子以配价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。血红蛋白（Hemoglobin, Hb) Hb (Mr 64500)几乎呈球形(d=5.5 nm)，四聚体，血红蛋白的四级结构显示了不同亚基间强的相互作用。11界面 (22) 间存在强相互作用，即使用尿素处理，得到的是完整的二聚体，界面间是明显的疏水作用，但也存在许多氢键和一些离子对作用。结合氧后引起结构改变 血红蛋白有两个主要的构象：R态(relaxed)和T态(tense)，氧可以与两种状态结合，但对R态的亲和力更大。无氧结合时，T态更稳定，表现出去氧血红蛋白的主要的构

8、象。T态因更多的离子对作用更为稳定，其中的多数存在于12（及 21)界面间。氧与Hb一个亚基的T态结合，引起构象改变为R态，当整个蛋白质发生这样的构象改变，单个亚基的结构几乎没有改变。但亚基对相互滑动和旋转，使得亚基间的口袋变窄。这一过程中，稳定T构象的一些离子对被打破，同时产生一些新的离子对。去氧血红蛋白的T状态TR转变。带正电荷的侧链（蓝色）和带负电荷的侧链（粉红色）形成离子对。每个亚基的Lys C5和每个亚基的Asp FG1能够看到，未作标记。与氧结合时血红蛋白的变构过程1.血红素中铁原子的变化 高自旋状态 低自旋（非氧合，原子半径较大） （氧合，原子半径较小）结合氧的血红素附近的构象变

9、化。Max Perutz假定TR的转变是由于血红素周围几个关键氨基酸侧链位置的改变所引起的。T态的血红素轻微皱褶，引起血红素铁突出His的侧链。氧的结合引起血红素呈现更平坦的构象，将His侧链改变而接触F螺旋。2.亚基三级结构及整个蛋白四级结构的变化铁原子的位移 F8His的位移 使F螺旋、EF拐角及FG拐角发生位移 F 螺旋向H螺旋移动 氢键断裂 导致四级结构的盐桥破坏 挤出BPG分子。脱氧血红蛋白与氧合血红蛋白构象的转变 T R紧张态 松弛态构象紧密 构象松弛氧亲和力低 氧亲和力高血红蛋白的变构别构蛋白：蛋白质分子中不止有一个配基的结合部位（活性部位），还有别的配基的结合部位（别构部位）。

10、别构蛋白都有别构效应。别构效应：蛋白质与配基结合后改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象。别构蛋白一般都是寡聚蛋白质。O2HbHb- O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血管中的PO20 20 40 60 80 100肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin血红蛋白输氧功能和构象变化S形（协同）结合曲线。可以看成反映低亲和与高亲和状态转变的杂合曲线。表明血红蛋白在组织和肺之间对氧浓度微小差异更为敏感，使得血红蛋白在高氧分压的肺中能够结合氧，在低分压的组织释放出氧。pH对氧与血红蛋白结合的影响。肺中血液的pH为7.6，组织的血液pH为7.2，实验测定血红蛋白与氧

11、的结合在pH7.4。H+、CO2和BPG 对血红蛋白结合氧的影响氧亲和力：指血红蛋白对于氧的结合牢固程度。（在一定氧分压下，氧亲和力越高，即氧结合越牢固。相反，氧亲和力越低，组织就能得到更多的氧供应）H+、CO2的影响：1914年，C. Bohr发现，高浓度的H+和CO2促使氧合血红蛋白分子释放O2，而高浓度的O2促使脱氧血红蛋白分子释放H+和CO2血红蛋白对O2、 H+和CO2结合的这种相互关系叫波耳效应。HbO2 +H+ +CO2HbH+CO2+ O2肌肉pH7.2肺泡pH7.6波耳效应的生理意义BPG的影响：BPG和O2对血红蛋白的结合是排斥的BPG降低血红蛋白亲氧能力的重要生理意义：

12、BPG是红细胞中存在的糖代谢中间产物。当血液流经O2分压较低的组织时，红细胞中的BPG可促进氧合血红蛋白释放氧，以满足组织对O2需要。 BPG浓度越大， O2的释放量越多。红细胞中BPG浓度的变化是调节血红蛋白对氧亲和力的重要因素。实例：在高山上；肺气肿病人；储藏血液。Po2Y1.0 0.5有BPG氧与血红蛋白的结合受2,3-二磷酸甘油酸（BPG）的调控 2,3-二磷酸甘油酸(BPG)与Hb的作用表现为一种向异性的变构调控行为。红细胞中BPG的浓度相对较高。BPG能大大降低Hb对氧的亲和力。 HbBPG + O2 HbO2 + BPG BPG结合Hb的位点与氧的不同，可以调控肺中与氧分压相关的

13、氧与Hb的亲和力。高纬度时，BPG对于较低氧分压的生理适应起着重要作用。健康人体在海面上能释放40%的氧进入组织，如果被迅速转移到4500米的山上(pO2低)，其向组织释放氧的能力降低。几个小时后血液BPG的浓度上升，降低Hb与氧的亲和力，这种调节对于肺中氧的结合影响不大，但对组织中氧的释放影响很大，可以恢复释放血液携带氧的40%进入组织。正常人位于海平面时血液中的BPG约为5 mM，高纬度时约为8 mM。BPG与去氧血红蛋白的结合。BPG的结合稳定去氧Hb的T态(a)，BPG所带负电荷与T态亚基口袋周围的正电荷侧链作用(b)，由于氧的结合，T态转变为R态，BPG结合的口袋消失(c)。煤气中毒

14、的机制一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红蛋白结合的能力是O2的200倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。血红蛋白分子病Molecular Disease of Hemoglobin有时候蛋白质上的一个点突变会造成对蛋白质结构和功能的巨大影响镰刀状细胞贫血病（Sickle-Cell Anemia）基因变异直接影响蛋白质特性，表现出不同遗传性状。例如人的镰形红血球贫血症。红血球碟形 HbAHbS突变HbC 红血球镰刀形血红

15、蛋白分子有四条多肽链： 两条链(141个氨基酸/条)； 两条链(146个氨基酸/条)。 HbA、Hbs 、Hbc氨基酸组成的差异在于链上第6位上氨基酸（亚基完全相同）：HbA第6位为谷氨酸（GAA、GAG)；HbS第6位为缬氨酸（GUA、GUG)；HbC 第6位为赖氨酸（AAA、AAG）由于链一个氨基酸的突变（6Glu6Val），去氧血红蛋白S的表面换成了一个疏水侧链，进一步引起分子发生线性缔合，形成长链，多条长链进一步聚集成多股螺旋的不溶性纤维。HbS与HbA的四级结构差别不大，但在低氧（脱氧）时，HbS的溶解度急剧下降（为正常脱氧Hb的1/25）。产生贫血症的原因：单个碱基的突变引起氨基酸

16、的改变导致蛋白质结构发生变化，直接产生性状变化。正常碟形红血球转变为镰刀形红血球缺氧时表现贫血症。 HbAHbS HbC蛋白质结构与功能的关系及其研究方法1、研究方法2、免疫体系中分子间的识别机制3、DNA与蛋白质的相互作用4、蛋白水解酶与疾病5、膜蛋白、受体与信号转导6、酶抑制剂与药物开发 7、新技术与新方法 X-Ray衍射NMR (核磁共振)Molecular Modeling (Simulation)Mutation/Function (分子生物学)结晶困难分子量不能太大理论不太完善费时费力免疫体系分子的识别机制Helper T cell-免疫体系的关键细胞 辅助T细胞巨噬细胞：吞噬抗原

17、-加工抗原-递呈给休止的辅助T细胞-辅助T细胞被活化-（1）激活免疫系统攻击已识别的抗原；（2）增生B细胞；（3）增生杀伤T细胞MHC IIKiller T Cell-保卫我们的主要战士杀伤T细胞对抗入侵细胞的卫士，但必须激活，首先要识别和结合特定的抗原片段-递呈抗原-MHC I-激活的杀伤T细胞进攻带有识别抗原的病毒并消灭之。MHC I两种T细胞上的MHC分子是特异性识别的关键主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)早期从组织器官移植实验中发现，也是当今免疫遗传学的主要内容。已发现，在人群或同种动物不同个体间进行皮肤移植时出现的排斥反应

18、，具有记忆性、特异性和可转移性等免疫反应的基本特征，故从廿世纪40年代起就确认移植排斥反应是一种典型的免疫现象。引起排斥反应的抗原称移植抗原(transplantation antigen)或组织相容性抗原(histocompatibility antigen)。此等抗原存在于细胞表面，无器官特异性，不同个体间其抗原特异性互不相同，但同卵双生及纯系动物不同个体之间，其抗原特异性完全一致。 类分子构槽(A)和类分子构槽(B)示意图 人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)。 HLA I类分子HLA II类分子MHC I类抗原分子顶部1和2区组成的抗原肽结合区呈沟槽

19、状结构，1和2区各含4股片层和1个螺旋，呈对称排列而连接成一个沟槽，片层组成槽底，其两侧由螺旋组成。沟槽大小为2.5 nm1.0 nm1.1 nm，可容纳8-12个氨基酸残基组成的短肽。沟槽内氨基酸变化大，是类抗原多态性的基础。虽然抗原肽与类分子的结合有一定的选择性，但并不像抗原与抗体那样高度特异地结合，只要被结合的多肽有2-3个关键的氨基酸能恰当地连接到沟槽内的多肽结合基序(binding motif)的相应位置上，多肽即可与之结合，并被运送到细胞表面递呈给T细胞。所以每个类抗原分子能与一定广度的多肽谱结合。链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为1、2和3 三个功能区。跨膜区含疏

20、水性氨基酸，排列成螺旋跨越脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。2m无同种特异性，与3功能区连接，其功能为有助于类抗原的表达和稳定性。MHC1分子的结构容纳抗原的口袋MHC II，1和1区各自盘绕成一个螺旋和片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。由于它的末端是开放的，故可容纳较长的多肽(约12-20个氨基酸)。该沟槽与多肽结合的特点基本上与类抗原相似，但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。 类抗原是由类基因编码的链(34kD)和链(29kD)非共价连接的糖蛋白。链和链在内质网分别合成后，很快与第3条链链(或称Ii链)结合成复合体，当复合体到达（内体/溶酶体

21、样结构)，链解离、降解。链的存在，使、链不能与其他胞内蛋白结合，并协助复合体转运到MHC，使之与抗原结合。链和链，均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区1、2和、2 蛋白质与DNA的相互作用Helix-Turn-Helix (HTH)Helix-Loop-Helix (HLH)Zinc-fingerLeucine zipper非特异性:特异性:HistonesDNA-蛋白质相互作用的化学键1、氢键:具有识别功能蛋白质的螺旋结构常与DNA的大沟相互作用。2、疏水键：暴露于大沟侧缘的T-CH3基团是疏水性的，可与疏水氨基酸残基侧链相互作用。3、离子键：蛋白质的带电的氨基酸残基的侧链与

22、DNA分子上的带电基团形成离子键。组蛋白(Histone) 组蛋白（与DNA非特异性结合） 组蛋白带正电荷，含Arg、Lys，碱性蛋白，含量恒定，真核细胞中组蛋白共有5种，分为两类：一类是高度保守的核心组蛋白（core histone）包括H2A、H2B、H3、H4四种；另一类是可变的连接组蛋白（linker histone）即H1。 核心组蛋白的结构非常保守，特别是H4，牛和豌豆H4的102个氨基酸中仅有2个不同。核心组蛋白高度保守的原因可能有两个：其一是核心组蛋白中绝大多数氨基酸都与DNA或其它组蛋白相互作用，可置换而不引起致命变异的氨基酸残基很少；其二是在所有的生物中与组蛋白相互作用的D

23、NA磷酸二酯骨架都是一样的。四种核心组蛋白通过C端疏水的氨基酸相互结合，N端带正电荷的氨基酸向外伸出，与DNA分子结合，使DNA分子缠绕在组蛋白核心周围，形成核小体。尾部含有大量Lys和Arg残基，为组蛋白翻译后进行修饰的部位，如乙酰化、甲基化、磷酸化等。 H1不仅具有属特异性，而且还有组织特异性，所以H1是多样性的。核小体的结构要点 每个核小体单位包括约200 bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1。 由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成盘状核心颗粒； H3、H4形成4聚体，位于颗粒中央； H2A、H2B二聚体分别位于两侧。 DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80

24、bp，共1.75圈，约146 bp，两端被H1锁合， H1 结合20bp DNA. 相邻核心颗粒之间为一段60 bp的连接线DNA (linker DNA)，典型长度60 bp。 组蛋白与DNA是非特异性结合，核小体具有自组装性质。非组蛋白 非组蛋白是染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，又称序列特异性DNA结合蛋白（凝胶迟滞电泳实验）。包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类、核质蛋白、骨架蛋白、基因表达和染色体结构调节蛋白等。（1）非组蛋白的特性 含有较多的Asp和Glu，酸性蛋白质；整个细胞周期都进行合成，不象组蛋白只在S期合成，并与DNA复制同步进行；能识别特异的DNA序列，识别信息存在于DN

25、A本身，位点在大沟部分，识别与结合靠氢键和离子键；具有多样性和异质性；具有多种功能，如帮助DNA分子折叠，以形成不同的结构域，从而有利于DNA的复制和基因的转录，协助启动DNA复制，控制基因转录，调节基因表达。（2）序列特异性DNA结合蛋白的结构模式 螺旋-转角- 螺旋模式（HTH) 蛋白质形成对称的同型二聚体，每个单位由20个氨基酸的小肽组成，两个螺旋相互连接成转角。羧基端的螺旋负责识别DNA大沟的特异碱基信息，另一个螺旋与磷酸戊糖链骨架接触。 锌指模式 (Zinc Finger) 每个锌指单位是一个DNA结合结构域，由30个左右氨基酸残基组成，其中一对Cys和一对His与Zn2+形成配位键

26、，锌指的C端形成 螺旋负责与DNA结合。亮氨酸拉链式模式 (Leucine Zipper) 蛋白质肽链的羧基端约35个氨基酸残基有形成a螺旋的特点，每两圈（7个氨基酸残基）有一个Leu残基。 螺旋一侧的Leu排成一列，两个螺旋间靠Leu间的疏水作用力形成一条拉链状结构。HTH Motif最初发现于噬菌体的阻遏蛋白中，现发现在很多原核及真核DNA结合蛋白中存在。由两个较短的螺旋与其间含Gly残基的绞链组成。如大肠杆菌的CAP蛋白含一HTH结构域，HTH通过DNA双螺旋大沟识别、结合反向重复序列TGTG/CACA。蛋白质与DNA的相互作用Helix-turn-helix，HTHHTH的分子识别机制

27、锌指结构(Zinc Finger Structure) 锌指结构：基因调控的转录因子存在于致癌基因、果蝇控制发育的基因、受生长因子和分化信号诱导合成的蛋白质序列中。 锌指区域：由四个Cys或二个Cys及二个His组成；保守序列Cys-N2-4-Cys-N12-14-His-N3-His。 锌指蛋白：213个手指，各由23氨基酸组成，并由78个氨基酸连接；与DNA大沟结合并环绕DNA分子，大沟与特异DNA碱基相互作用。Zinc-finger蛋白结构特征指状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个Cys或2个Cys和2个His相结合。整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。每一个单位可

28、以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。如与GC框结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。Cys2/His2锌指结构12 AAs碱性亮氨酸拉链 (bZIP)可形成蛋白质蛋白质二聚体的亮氨酸拉链 (leucine zipper，LP)；具有35个氨基酸残基，其中有4个亮氨酸，每7个氨基酸出现一次，形成-螺旋时， 每两圈伸出一个亮氨酸，由亮氨酸残基间的疏水作用力形成一条拉链，产生蛋白质二聚体；碱性-螺旋与DNA磷酸残基和碱基互作，二聚体剪刀结构。Leucine-zipper的结构特征蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有1个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在螺旋的同一个方向出

29、现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。这类蛋白质能够与CAAT框和病毒增强子结合。 Leucine Zipper蛋白的剪刀型结合模式足迹法研究DNA结合蛋白的结合位点DNA Foot Printing足迹法技术用于测定与特殊蛋白质结合在DNA上的结合位点和相应的核苷酸顺序。如该技术提供了RNA聚合酶与启动子之间相互作用的信息并确定了作用位点（启动子）的核苷酸顺序。研究蛋白质在DNA上的结合位点的Foot Printing由含70RNA多

30、聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子蛋白水解酶与人类疾病Cardiovascular diseases 心血管疾病Hemophilia A/B 血友病Programmed cell death / appotosis 细胞凋亡Alzheimer disease 痴呆Cancer metastasis 癌细胞转移Pulmonary emphysema/pancreatitis/arthritis 肺气肿/胰腺炎/关节炎Parasite disease: malaria/T cruzain 疟疾Influenza A & AIDS 甲型流感与爱滋病细胞内蛋白质有确定的寿命Proteosome是蛋白质降

31、解的专业机构蛋白质降解的泛素蛋白酶体途径 泛素(ubiquitin，Ub)是76个氨基残基组成的小分子多肽，可以以共价结合的方式与蛋白质的赖氨酸残基相连。蛋白质一旦接有泛素，称为发生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在ATP的参与下被三种酶依序催化，形成蛋白质与一条泛素聚合链相结合的复合结构，进入蛋白酶体，然后降解为肽段。此为生物大分子在胞质中降解的泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteosome pathway)。泛素化是一个具有普遍意义的免疫生物学现象。蛋白质降解的泛素蛋白酶体途径 蛋白质泛素化系统由3个组分构成，一个称为泛素激活酶E1，它可利用水解ATP释放的能量以

32、其 Cys的巯基与泛素C端的Gly形成高能硫酯键。然后连接在其上的泛素被转移到另一个泛素结合酶E2上，同时，被选中的靶蛋白与第三个组分即靶蛋白泛素连接酶E3结合。E2然后将与其连接的泛素转移到靶蛋白上，并与靶蛋白 Lys -NH2基团形成异肽键(isopeptide bond)，E2被释放。选择什么样的蛋白质进行泛素化主要取决于E2和E3。血栓形成（Thrombosis） 活体心脏、血管内血液的某些成分析出，凝集形成固体质块的过程称血栓形成，形成的固体质块叫血栓。内膜损伤后血小板粘集，形成血小板小堆；以后内源性凝血系统、外源性凝血系统激活，形成纤维蛋白，血小板与纤维蛋白等形成血小板血栓，阻碍血

33、流，血流下游形成漩涡，形成新的血小板血栓，如此往复形成不规则梁索状或珊瑚状突起，称为血小板小梁，在小梁间则由网有大量红细胞的纤维蛋白网填充。后血栓逐渐增大，阻塞血管，血流停止，血液发生凝固，形成更大血栓。 血栓形成与消除1. 溶解吸收2. 机化再通3.软化脱落栓子栓塞梗死 组织型纤溶酶原激活剂 纤溶酶原激活物抑制物 血纤维蛋白溶酶原 溶纤酶甲型流感病毒与艾滋病毒流行性感冒病毒简称流感病毒，是引起流感的病原体。流感是一种上呼吸道急性传染病，它传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高。已引起数次世界性大流行，仅19181919年的世界大流行，死亡人数就达2000万，对人类的生命健康危害极大。Influ

34、enza Virus流感病毒（Influenza virus）属正粘液病毒科，流感病毒属，包括甲、乙、丙三型，甲型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，引起中、重度疾病，侵袭所有年龄组人群，常引起世界性大流行。乙型变异性较弱，仅感染人类，一般引起轻微的疾病，主要侵袭儿童，可引起局部爆发。丙型抗原性比较稳定，仅引起婴幼儿感染和成人散发病例。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型（H1H15），N有9个亚型（N1N9）。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。 Life Cyc

35、le of Influenza A virusA型流感病毒的H抗原蛋白的结构域受蛋白水解酶活化后才有感染细胞的能力艾滋病（AIDS)艾滋病的医学全称是“获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，缩写AIDS ）”，其病原为“人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，缩写HIV）”。HIV专门攻击人体的T淋巴细胞，致使人体免疫功能缺陷，进而导致人体丧失了对各种病原体的抵抗能力而发生多种机会性感染、恶性肿瘤和多系统损害的综合征，最终导致死亡。外界环境中的生存能力较弱，对物理因素和化学因素的抵抗能力较低。对热很敏感，

36、56 处理 30min 可使其在体外对人的 T淋巴细胞失去感染性，但 不能完全灭活血清中的HIV，100处理20 min可将其完全灭活。除此之外，75%的酒精也可灭活，但紫外线不能灭活。变异强：艾滋病毒的变异性很强，给研制预防性疫苗和治疗性药物带来了极大困难。易感性：人群普遍易感，无国界、无季节性。HIV感染与人类的行为密切相关，如：多性伴、吸毒等。env：囊膜蛋白（包膜蛋白） gag：核心蛋白Gag：gag基因产生55 kD的蛋白p55，p55由病毒编码的一个蛋白酶切成四个小蛋白：MA（p17基质）、CA（p24衣壳）、NC（p9核衣壳）、及p6。 Pol：Gag-Pol融合蛋白由病毒编码的

37、一个蛋白酶切为四个小蛋白：Pro（p10蛋白酶）、RT（p50逆转录酶）、RNase H（p15 RNA酶H）、及INT（p31整合酶）。Env：Env起先是160 kD的蛋白，在高尔基体中经糖基化，在天冬酰胺上被加上25至30个复杂的N连糖链，成为gp160；这个糖基化过程对感染性是必要的，之后，宿主细胞的一个蛋白酶将gp160切为gp41与gp120。 AIDS病毒生活史有个必须的Protease癌细胞的转移需要蛋白水解酶的帮助组织蛋白酶B可消化层粘连蛋白、纤粘连蛋白、胶原、蛋白聚糖及其他基底膜组分，因此有人推测该酶可能与癌细胞转移有关。后来在人前列腺癌的侵袭细胞和毛细血管中证实了这一推测

38、。这种酶也许可以作为癌转移的标志物，胃肠道癌症病人的血清和尿液中酶的含量都高于健康人群。更重要的是肝、肺癌转移的患者该酶的含量高于未转移者。恶性肿瘤切除后可恢复至正常水平。基底膜的消化作用使肿瘤细胞得以进入结缔组织，因此肿瘤细胞的攻击性与蛋白水解酶水平呈正相关不足为奇。膜蛋白、受体与信号转导白细胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6) 细胞来源: 主要由单核巨噬细胞、 Th2细胞、 血管内皮细胞、成纤维细胞产生。主要功能（1）刺激活化细胞增殖，分泌抗体； （2）刺激细胞增殖及CTL活化；（3）刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应；（4）促进血细胞发育。白介素-6(Interle

39、ukin-6)的信号转导STAT:signal transducer and activatior of transcription(信号转导子和转录激活子）JAK: janus kinase Acute-phase response factor成纤维细胞生长因子（FGFs） 主要来自牛脑和脑垂体的提取液，是大约150 个氨基酸结构的酸性或碱性成纤维细胞生长因子（FGF：FGF1或FGF：FGF2），氨基酸的同源性为20%50% 。其后分离的癌基因产物的细胞增殖因子与上述FGFs结构类似，也被分类在FGFs家族，并依次命名为FGF3 9。目前已发现23种 FGFs。 FGFs作为细胞间信号分

40、子在胚胎发生和分化过程中起重要作用。FGF的信号转导几条信号转导途径什么是生物芯片技术？以微点阵排列技术（Microarray Technology）将生物大分子固定到适当的固体载体上，方便各种生化和分子生物学的操作。蛋白质芯片技术（Protein Chips，Protein Array）基本原理：将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。依据的杂交反应原理:抗原-抗体反应配体-受体反应蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质芯片的操作过程1.将抗原或抗体交联（UV）或吸附在膜上；2. 抗体或抗抗体标记示

41、踪；酶：HRPO、AP胶体金荧光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻胆蛋白等3.检测标本中的抗体或抗原。点抗原测抗体点抗原测抗体点抗体测抗体-捕获法点抗体测抗原蛋白质芯片筛选新药的原理受体、酶的微点阵与中草药抽提物反应后再与受荧光标记的配体或底物结合以激光进行检测不出现荧光的点表明中草药样品中含有与这些点上的蛋白质相互作用的物质，因此是作用于这些位点的新药候补。荧光基因芯片操作程序经典的DNA芯片数据DNA芯片的操作过程利用半导体技术的DNA芯片酵母双杂交(Yeast Two Hybrid) 技术蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础。随着分子生物学技术的发展，特别是人类基因组计

42、划的完成，使人类对基因的结构和功能的认识不断加深，但基因编码的蛋白质的功能研究尚是一个难题。酵母双杂交系统利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，该方法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白质。酵母双杂交的原理利用酵母作为真核蛋白质相互作用的模型利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用使用不同的培养基筛选阳性克隆酵母双杂交由Fields 等在1989 年提出，是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域，位于N 端1-

43、174 位氨基酸残基区段的DNA 结合域(DNA-BD)和位于C 端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain，AD)。DNA-BD 能够识别位于GAL4 效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence, UAS)，并与之结合。而AD 则是通过与转录机构(transcription machinery)中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活U

44、AS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。酵母双杂交体系UAS: Upstream activating sequence,酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白质蛋白质的相互作用。主要有二类载体: a. 含DNA -binding domain的载体; b. 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence, NLS)， 而GAL4-

45、ad没有。因此在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 另一个重要的元件是报道株，报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 1 易于转化、便于回收扩增质粒。2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3酵母的内源性蛋白不易与来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转

46、入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交模型DNA-BindingDomain诱饵蛋白Bait Protein捕获（猎物）蛋白Prey ProteinTranscriptionActivatingRegionReporter GeneDNA-Binding Site模 型文库筛选的步骤将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒。将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母。再将文库质粒转化到酵母中。通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。转基因动物Transgenic Animals什么是转基因动物 将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转 入的外