氨基酸的鉴定(纸层析法)

1、氨基酸的鉴定（纸层析法）实验目的：1、掌握纸层析法的基本原理2、通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并学会分析未知样品中的氨基酸组分。实验原理：1、层析法又称色谱法（Chromatography）,是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附办、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,并使各组分以不同速度移动,从而得到有效的分离。操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等。分离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。2、纸层析法是用滤纸作为情性支持物的分配层析法,展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟

2、基具有亲水性,在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时,层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。井丽茅數K-溶质在固定相中的浓度一溶质在流动相中的滾厲物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示:原点到层析点中心的距离原点到溶钿前沿的距离珞刑前沿上行法层杆示意13、在一定条件下，物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。4、本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。试剂:1、

3、酸性展层剂正丁醇：88%甲酸:水=15:3:2V/V2、显色储备液:0.4mol/L茚三酮-异丙醇：甲酸:水=20:1:53、标准氨基酸溶液（6mg/ml,苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His）4、未知样品液：上述4种氨基酸中的一种或几种混合液（每组任选一个样品）实验器材：、滤纸、烧杯3、剪刀4、毛细管5、层析缸6、微量注射器7、电吹风8、保鲜膜操作方法：一、点样1、量取30ml层析溶剂、1ml显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。（展层缸洗净后应除去多余的水，否则会影响展层溶剂的比例而影响展层）2、戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪裁为18cmX14c

4、m。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。（点样操作时应戴手套，防止样品及滤纸受污染）3、用毛细管将标准氨基酸及未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。二、层析与显色1、将滤纸卷成圆柱形，用针线缝合或钉书针固定成圆筒状，纸的两边不能接触。2、将滤纸竖直放入盛有展层剂的层析缸中，迅速盖紧层析缸盖（点样点的一端在下，展层剂液面需低于点样线1cm左右。3、待溶剂前沿线距滤纸末端12cm（展层长度10cm，约2hr）时，取出滤纸（需带上手套）4、用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹千（通风橱中进

5、行），即可见层析斑点。结果处理：用铅笔将层析图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到溶剂前沿的距离。计算各种标准氨基酸的Rf值，并根据样品分离的情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。、点样点1-His2-Phe3-Gly4-Pro5-A18距离/cm一、点样点到层析点中心0.85.61.63.60.9/3.9/6.2点样点到溶剂前沿&6&6&5&6&6Rf(His)=0.8/8.6=0.093Rf(Phe)=5.6/8.6=0.651Rf(Gly)=1.6/8.5=0.188Rf(Pro)=3.6/8.6=0.419样品：下：Rf=0.9/8.6=0.105中：Rf=3.9/8.6=0.453上：Rf=6.2/8.6=0.721混合样品中氨基酸的组分为：His、Pro、Phe误差分析：1、样品点样不足，显色不明显。2、点样时温度较高，氨基酸浓度发生变化。3、滤纸边缘不齐，影响氨基酸扩散速度。4、显色时，热风温度不够，显色不明显。5、测量不精确，扩散距离存在误差。注意事项：1、严格控制点样位置以及点样直径，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，同时点样点应高于展层剂液面。2、点样时宜采用冷风吹干。3、展层剂需临用时配制，以免发生酯化而影响层析结果。展层剂比例应保持不变，因此展层缸应保持干燥。4、若样品中溶质种类较