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文档简介

1、培育条件决议由戊糖乳杆菌LPS26消费的两种细胞外多糖的平衡Jorge-Ignacio Sanchez,1 Beatriz Martnez,1 Rafael Guillen,2Rufino Jimenez-Daz,2 and Ana Rodrguez1* 第三学习小组全体成员:刘一辰 田凯 边鑫 陈果 靳慧杰 王向宇 高陆 李宏岳 王乐乐 .摘要 从绿橄榄自然发酵物中分别得到的戊糖乳杆菌LPS26,可以消费一类由两种胞外多糖(EPS)组成的荚膜多聚物:EPS A,一种高分子量胞外多糖,由葡萄糖和鼠李糖3:1组成;EPS B,一种低分子量胞外多糖,由葡萄糖和甘露糖3:1组成。经过运用不同碳源葡萄

2、糖、果糖、甘露醇和乳糖的化学半限定培育基及温度和pH影响的分析阐明培育基的条件对于由菌株LPS26消费的EPS的类型和浓度有很明显的影响。这是第一篇关于由戊糖乳杆菌产EPS的报道。 .前言 微生物胞外多糖EPS是一类范围广泛的分泌多聚物,既可以严密衔接在细胞外表荚膜多糖,也可以胞外多粘物质分泌到胞外。这些分子以作为乳化剂、稠度剂、粘度计和稳定剂运用于食品方面。由于乳酸细菌LAB是食品级的,因此它消费的EPS引起了人们越来越多的兴趣。 LAB消费的EPS可以由一种糖单体构成同聚多糖,也可以由几种单体构成杂多糖。由不同菌株消费的EPS在糖成分、链长、支化程度以及糖键类型上有所不同。 .前言 迄今为

3、止,这些EPS作为生物组分在食品工业上的运用很大程度上遭到了LAB低产量40到600mg L-1的限制。因此,高效地由LAB消费EPS的条件应该被优化。 近年来由乳酸杆菌消费EPS已被报道。但迄今为止还没有关于由戊糖乳杆菌消费EPS的特点的报道。对此,我们研讨了由戊糖乳杆菌LPS26消费的两种不同的EPS。根据我们的结果,两种EPS的比率可以被调理并且产物程度可经过培育条件而被优化。 .资料和方法 菌株和培育基条件 对细胞外表进展化学处置 EPS的分别纯化 EPS的定量 单糖的分析 发酵条件 动力学参数 以牛奶进展培育 统计学分析.1 菌株和培育基条件戊糖乳酸杆菌LPS26 L. pentos

4、us LPS26乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947 Lactococcus lactis subsp. lactis IPLA947 可在优化的半合成培育基SDM中培育获得细胞外多糖EPS培育基组成: 吐温80Tween 80 1g/L 柠檬酸铵 2g/L 乙酸钠 5g/L MgSO47H2O 0.1g/L MnSO4 0.05g/L K2HPO4 2g/L 酵母浸粉 5g/L 蛋白胨 10g/L pH 6.0 为进一步优化培育基成分,添加不同碳源进展实验。.2 对细胞外表进展化学处置每10ml样品过夜培育后以5ml以下任何一种溶液重悬处置:30质量分数的十二烷基磺酸钠于45C下处置30min0

5、.05M NaOH于20C处置30min蛋白酶K1.5mg/ml于50C处置30min.3 EPS的分别纯化 在前人方法上进展改良如下:10ml样品以30W 1Hz超声波处置了10min 用10质量分数的三氯乙酸搅拌处置30分钟 410000g离心10min以去除细胞核蛋白 以2倍体积的酒精沉淀过夜 ,重溶于1ml蒸馏水中 4中透析48h,期间每12h换水一次 纯真的EPS被冻干以便于进展进一步定量和成分分析 .4 EPS的定量 对含EPS的样品进展高压液相色谱(HPLC)系统进展过滤层析(SEC) ,组分用一个以TSK-Gel precolumn柱维护的TSK-Gel G5000 PWXL柱

6、搜集。HPLC条件如下:流动相是0.1M的NaNO3柱温是40流速是0.6ml/min进样量是50ul.5 单糖的分析 存在两种EPS (EPS A and EPS B)分别得到的EPS蒸馏水透析48h以去除来自流动相的NaNO3然后将其冻干依托根据alditol acetate方法进展的气相色谱来测定多糖成分样品以丙酮1ul对应每ug EPS溶解经过与Hewlett-Packard 5972选择性质量检测器衔接的Series II Hewlett-Packard 5890仪和按流注射方式操作的一根石英毛细管0.25 mm by 30 m; SPTM 2330进展分析烤箱的温度坚持在220.6

7、 发酵条件一切的发酵实验都是在一个750ml的含葡萄糖20g/L 的SDM培育基中进展的 以30C过夜培育的培育物按2体积分数接种 经过一个InPro 3000/225探针进展丈量后自动补加5.7N的NH4OH来控制pH转速为150rpm 当菌体到达指数生长期时,补加新颖的培育基使之开场从最低稀释度下进展发酵分别对多种碳源葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇,不同糖浓度5,20,30和40g/L,不同温度20,25和30C以及不同pH程度6.0,5.0和不进展控制进展了实验 对细菌的生长情况以CUF/ml表示,pH未控制pH培育物和产物EPS的量进展了测定,HPLC对糖和有机酸进展检测.7 动力学参数最

8、大生长率maxlnX1-X0/t1t0,其中X1和X0是CFU/ml的数,t0和t1是对数生长期起止时间EPS产率(YEPS)以每克糖产生的EPS毫克数表示单位体积产率(Pv)以每小时每升培育液中产生的EPS毫克数表示 .8 以牛奶进展培育在商品UHT培育基添加了2的脱脂乳糖粉末作为两种菌的培育基两种菌分别在MRS和M17培育基上过夜培育,以它们作为接种体在25C下培育72小时后每毫升戊糖乳酸杆菌LPS26长出了2107个菌落,乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947那么长出了7.5106个 .9 统计学分析数据依托电脑软件进展了差别分析和最小差别意义监测分析验证P0.01 .资料和方法 乳酸乳球菌乳

9、酸亚种IPLA947 Lactococcus lactis subsp. Lactis IPLA947 1. 菌株和培育基条件 戊糖乳酸杆菌LPS26 L. pentosus LPS26.资料和方法这两种菌株可在优化的半合成培育基SDM中培育获得细胞外多糖EPS培育基组成: 吐温80Tween 80 1g/L 柠檬酸铵 2g/L 乙酸钠 5g/L MgSO47H2O 0.1g/L MnSO4 0.05g/L K2HPO4 2g/L 酵母浸粉 5g/L 蛋白胨 10g/L pH 6.0 为进一步优化培育基成分,添加不同碳源进展实验。1. 菌株和培育基条件.资料和方法2. 对细胞外表进展化学处置每

10、10ml样品过夜培育后以5ml以下任何一种溶液重悬处置:30质量分数的十二烷基磺酸钠于45C下处置30min0.05M NaOH于20C处置30min蛋白酶K1.5mg/ml于50C处置30min.资料和方法3. EPS的分别纯化在前人方法上进展改良如下:10ml样品以30W 1Hz超声波处置了10min 用10质量分数的三氯乙酸搅拌处置30分钟 410000g离心10min以去除细胞核蛋白 以2倍体积的酒精沉淀过夜 ,重溶于1ml蒸馏水中 4中透析48h,期间每12h换水一次 纯真的EPS被冻干以便于进展进一步定量和成分分析 .资料和方法4. EPS的定量 对含EPS的样品进展高压液相色谱(

11、HPLC)系统进展过滤层析(SEC) ,组分用一个以TSK-Gel precolumn柱维护的TSK-Gel G5000 PWXL柱搜集。HPLC条件如下:流动相是0.1M的NaNO3柱温是40流速是0.6ml/min进样量是50ul.资料和方法5. 单糖的分析存在两种EPS (EPS A and EPS B)分别得到的EPS蒸馏水透析48h以去除来自流动相的NaNO3然后将其冻干依托根据alditol acetate方法进展的气相色谱来测定多糖成分样品以丙酮1ul对应每ug EPS溶解经过与Hewlett-Packard 5972选择性质量检测器衔接的Series II Hewlett-Pa

12、ckard 5890仪和按流注射方式操作的一根石英毛细管0.25 mm by 30 m; SPTM 2330进展分析烤箱的温度坚持在220.资料和方法6. 发酵条件一切的发酵实验都是在一个750ml的含葡萄糖20g/L 的SDM培育基中进展的 以30C过夜培育的培育物按2体积分数接种 经过一个InPro 3000/225探针进展丈量后自动补加5.7N的NH4OH来控制pH转速为150rpm 延续发酵:当菌体到达指数生长期时,补加新颖的培育基使之开场从最低稀释度下进展发酵分别对多种碳源葡萄糖、乳糖、果糖和甘露醇,不同糖浓度5,20,30和40g/L,不同温度20,25和30C以及不同pH程度6.

13、0,5.0和不进展控制进展了实验 对细菌的生长情况以CUF/ml表示,pH未控制pH培育物和产物EPS的量进展了测定,HPLC对糖和有机酸进展检测.资料和方法7. 动力学参数最大生长率maxlnX1-X0/t1t0,其中X1和X0是CFU/ml的数,t0和t1是对数生长期起止时间EPS产率(YEPS)以每克糖产生的EPS毫克数表示单位体积产率(Pv)以每小时每升培育液中产生的EPS毫克数表示.资料和方法8. 以牛奶进展培育在商品UHT培育基添加了2的脱脂牛奶粉末作为两种菌的培育基两种菌分别在MRS和M17培育基上过夜培育,以它们作为接种体。在25C下培育72小时后每毫升戊糖乳酸杆菌LPS26长

14、出了2107个菌落,乳酸乳球菌乳酸亚种IPLA947那么长出了7.5106个 .资料和方法9. 统计学分析数据依托电脑软件进展了差别分析和最小差别意义监测分析验证,结论为极为显著P0.01. 图1.高压液相色谱分析L. pentosus LPS26产生的EPS分析显示存在分别对应两个峰的两种多聚物,一种大分子量high-Mw多聚物EPS A,分子量1.9106 Da,另一种小分子量多聚物EPS B),分子量3.3104Da。实验结果EPS的组成.气相色谱-质谱分析显示两种EPS的单糖组成是不同的。EPS A由葡萄糖和鼠李糖组成,其物质的量之比近似为3:1,然而EPS B由葡萄糖和甘露糖组成,比

15、例类似。实验结果EPS A&B组成.甘露醇和果糖分别提供了最高黄和最低绿的活菌数,但是甘露醇和葡萄糖之间没有检测到明显的差别。果糖和甘露醇导致较低的EPS合成,然而葡萄糖和乳糖那么是更适宜EPS产生的糖源。EPS A似乎比EPS B更依赖于特定碳源用甘露醇,葡萄糖和乳糖发酵得到的EPS A占有更高的比率。但是,用果糖发酵那么得到相反的比率。用不同碳源发酵,两种EPS的单糖组成的差别都很小。实验结果碳源的影响.随着糖源浓度添加,活菌数增多。EPS随着初始葡萄糖浓度的添加而添加。葡萄糖浓度在5克每升时,EPS产量最大, 2040g/L时,EPS产量持在很窄的范围内,且EPS A和EPS B的比率不

16、受葡萄糖浓度的影响。实验结果糖浓度的影响.温度影响两种EPS的产量,从EPS A的产量可以看出温度与EPS的产量呈负相关性。20的总多聚物量是25条件下的1.2倍、是30条件下的1.6倍。20条件下的EPS产量也比25和30条件下的多。相反的,经过20和25的显著不同可以得出低温降低活菌数。实验结果温度的影响.对pH进展调理可提高两种EPS的产量,而且EPS B的效果尤为明显。pH5.0时可检测出更多的活菌数。EPS产量在pH6.0 时明显高于 pH5.0 和不调理 pH的两组。实验结果pH的影响.根据不同温度和不同pH条件下的实验,确定了一个适宜L. pentosus LPS26的生长条件用

17、于消费EPS。L. pentosus LPS26培育于SDM中,葡萄糖含量30g/L,pH6.0,20培育。我们可以确定总EPS的产量为511mg/L。实验结果最优培育条件.在D0.02 h-1时得到最大的EPS A产量,而更高的稀释度会导致产量显著下降。从0.02到0.07 h-1的稀释度范围内,只得到很少的EPS B50mg每升,因此,EPS B的产量似乎不受生长率的影响。极稀的稀释度下0.02到0.04 h-1,葡萄糖耗费量和乳酸盐的生成量类似。在更高的D值0.07到0.11 h-1下,残留的葡萄糖增多,而乳酸盐浓度降低。在D0.02 h-1时,EPS产量最大18.9mgEPS/g葡萄糖

18、,单位体积产率Pv最大7.08mgL1h1。实验结果延续培育的影响.在牛奶和补加葡萄糖和酵母提取物的牛奶中,对LPS26和酸化的L.lactis进展结合培育。在牛奶培育基中,EPS产量很低,但主要产生的是EPS B。对牛奶培育基进展补充后,不仅微生物量有了明显的添加LPS26 2.5108CFU ml-1和IPLA947 1.8109CFU ml-1而且EPS B有了极大的增长,所以EPS总产量也有了明显的增长162.9mg/L实验结果牛奶培育基的影响.我们的结果显示培育条件对L.pentosus的生长和产生EPS有明显的影响,并可以证明用分零售酵时EPS产量高达511mg/L。碳源对L.pentosus LPS26的生长和产生EPS的量以及两种EPS的比率有明显的影响。葡萄糖提供EPS的高产量而且明显更支持EPS A 的合成。相反,果糖更利于EPS B 的合成。L.pentosus LPS26的生长和EPS的

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