基因工程制药

1、关于基因工程制药第一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月基因工程定义：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行剪切和组合，然后与载体拼接，并通过载体转入到另一种生物体（受体）内，使其按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的三大要素： 供体，受体和载体第二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行剪切和组合，然后与载体拼接，并通过载体转入到另一种生物体（受体）内，使其按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的三大技术： 剪切，连接和转入第三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 除了少数RNA病毒

2、外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术（DNA Recombination）。 另外，DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖（Molecular cloning）。第四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。第五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出

3、了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。在普遍光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的光线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。 第六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月基因工程基本过程第七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程）； 而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过

4、程。第八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。第九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月从DNA出发的基因工程基本流程示意图供体细胞DNA抽提供体纯DNA剪切或PCR载体连接受体细胞DNA重组分子转入重组子复制表达产品分离纯化第十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月基因工程的基本过程（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称“切”）；第十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月第十二张，PPT共

5、二百三十二页，创作于2022年6月（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”）；第十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）；第十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称“增”）第十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”）；第十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 可见，基因工程的上游操

6、作过程可简化为：“切、接、转、增、检”五步）；第十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月Example：Transfer of the Insulin（胰岛素） gene into a plasmid vector第十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 基因工程的六大步骤： 一. 目的基因的获得； 二. 载体的制备； 三. 基因和载体的体外重组； 四. 重组基因的导入和重组子的检测； 五. 克隆基因的表达； 六. 基因工程产物的检测或分离第十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月理论基础不同基因具有相同的物质基础；基因是可切割的；基因是可以转移的；多肽和基因之

7、间存在对应关系；遗传密码是通用的；基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。第二十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月1. 不同基因具有相同的物质基础 基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。第二十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 不同基因具有相同的物质基础。地球上的一切生物，从细菌到高等动物和植物，直至人类，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。虽然某些病毒的基因定位在RNA上，但是这些病毒的RNA仍可以通过反转录产生。DNA并不影响不同基

8、因的重组或互换。A：肺炎双球菌转化实验1944年美国微生物学家Avery，通过细菌（肺炎链球菌）转化（有毒与无毒）研究确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。B：噬菌体转染实验1952年Alfred Hershy和Marsha Chase用标记物的噬菌体（P32和S35）感染大肠杆菌，发现只有P32标记的DNA注入寄主细胞才能繁殖下一代进一步证明遗传物质是DNA。第二十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月碱基的结构A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶第二十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月DNA的结构第二十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月2.

9、 基因是可切割的 限制性内切酶（Restriction Enzyme），如EcoRI，HindIII等。第二十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 基因直线排列在DNA分子上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许从DNA分子上一个一个完整地切割下来。即使是重叠排列的基因，也可以把指定的基因切割下来，尽管破坏了其他基因。第二十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 限制酶EcoR1识别与切割序列限制酶Pst1识别与切割序列第二十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月限制酶Hind的识别与切割序

10、列第二十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月限制性内切酶常用限制性内切酶种类及特性W. Arber和H. O. Smith第二十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 几乎所有种类的原核生物都能产生限制酶。根据结构和功能特性，可将限制酶分为三大类。 其中类和类酶属复合功能酶，它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中，因此，严格地说应该称为限制-修饰酶。 类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属于同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点特异，能产生固定的DNA片段，因此基因工程所用的限制酶都是类限制酶。第三十张，PPT共二百三十

11、二页，创作于2022年6月其它工具酶连接酶T4 DNA Ligase 1967修补工具酶DNA聚合酶I 大片断 Klenow 1971末端加工酶S1核酸酶 ， 碱性磷酸单脂酶末端转移酶人工加polyA 或polyT 尾反转录酶第三十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月几种聚合酶特性比较第三十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月3. 基因是可以转移的 基因不仅是可以切割下来的，而且发现生物体内有的基因可以在染色体DNA上移动，甚至可以在不同染色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子之中。4. 多肽和基因之间存在对应关系 现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转

12、移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。第三十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月5. 遗传密码是通用的生命的语言第三十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月所谓“中心法则”，是指遗传信息在细胞内的生物大分子之间转移或传递的基本法则。 第三十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 遗传密码是通用的。一系列三联密码子（除极少数的几个以外）同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。也就是说遗传密码是通用的，重组的 DNA分子不管导人什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，均能转译出原样的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因）同样可以转录翻译出相应的氨

13、基酸。现在，基因是可以人工会成的。第三十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月6. 基因可以通过复制把遗传信息传给下一代经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。第三十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月分子克隆载体第三十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 基因载体是一类能自我复制和功能基因表达的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。第三十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月载体的分类： 从构建载体的DNA来源分，有质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DN

14、A与病毒或噬菌体DNA组成的载体、以及质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体等。 从功能方面它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。 从表达所用的受体细胞分，可分为原核细胞和真核细胞表达载体。 第四十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月基因载体应具备的条件： 载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制，因此载体应是一个独立的复制子，具有复制起始序列，可在细胞中进行有效扩增； 载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入。并且由于这些酶切位点位于载体复制的非必需区，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍然能够进行正常的复制； 载体必须具有可供选择的遗传

15、标记，例如具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。 第四十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体第四十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月抗药性标志的选择载体AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第四十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月常规质粒载体第四十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月质粒(plasmid ) 独立于细菌染色体以外的具有独立自主复制和调控能力的共价、闭合、环状的双股DNA分子（既cccDNA)。 Plasmid chromosome 第四十五张，P

16、PT共二百三十二页，创作于2022年6月质粒克隆载体的特性: (1)具有独立复制起点 这是质粒在宿主细胞中进行扩增的必要条件。 (2)具有较小的相对分子质量 相对分子量小有利于DNA的分离和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超过15kb。 (3)具有较高拷贝数 每个细胞可含有10200个拷贝的松弛型复制质粒,使外源DNA得以大量扩增。第四十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 (4)具有选择性标记 如抗生素的抗性基因，便于对克隆基因的检测和筛选。 (5)易于导入细胞 质粒可通过转化或电穿孔等方法极易被导入细胞。 (6)具有安全性 作为载体的质粒不具有转移功能，防止带有

17、外源DNA的重组质粒扩散至实验室外，以免造成危害。第四十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr第四十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6

18、月人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选第四十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 大肠杆菌质粒pBR322是基因工程中最常用和

19、最具代表性的质粒，它是由Bolivar和Rogigerus等人于1977年构建而成的，是一个典型的人工质粒载体。 质粒pBR322结构第五十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月松弛型复制 pBR322： 氯霉素可扩增 用于基因克隆 第五十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月可插入外源DNA大小为5kb左右，外源DNA若超过10kb，质粒在复制时就会变得不稳定。它具有一个复制起点，是松弛型质粒，故细胞中具有较高的拷贝数，每个细胞含有2030个拷贝。当加入氯霉素扩增之后，每个细胞可含有10003000个拷贝，大大有利于重组质粒在细胞中的扩增。第五十二张，PPT共二百三十二页，

20、创作于2022年6月 pBR322还具有两种抗生素的抗性基因，一个是四环素抗性基因(Tetr)另一个是氨苄青霉素抗性基因(Ampr)。 已知有24种主要限制酶在pBR322上都只有一个切点，其中有7种限制酶(E.coRV、Nhe I、BamHI、Sph I 、SalI、XmaIII、Nru I)的切点位于四环素抗性基因之内，还有3种限制酶(Sca I、PvuI和PstI)的切点位于氨苄青霉素抗性基因之内。第五十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活(insertional inactivation)。第五十四张，PPT共二百三十二页，

21、创作于2022年6月噬菌体载体第五十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 噬菌体是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下,上述两种状态还会相互转化。 噬菌体的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。第五十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月噬菌体生物学特性： 噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情

22、况为溶原状态。 整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。 人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态. DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态第五十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月噬菌体的 C 蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体 DNA 整合到细菌的染色体中去。 高浓度的 C 蛋白促进溶源化，而低浓度 C 蛋白促进裂解生长。 当 C 蛋白浓度足够时，激活基因 c 和基因 int 的表达，导致噬菌体 DNA 整合到宿主的染色体上。

23、第五十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月噬菌体的生活周期： 裂解侵入细菌-独立复制-裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。 第五十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。 诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导: 分离得到某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。 cl ts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在cl ts857下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。CIts857第六十张，PP

24、T共二百三十二页，创作于2022年6月l 噬菌体结构5TCCAGCGGCGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l- DNA第六十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 结构特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。例如: 所有的编码外壳蛋白的基因都聚集在左端1/3处； 控制基因组整合到寄主基因的基因位于分子中央； 右端是负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控的基因； 相关基因的聚集对基因组的表达是非常重要的，这能够使他们一起启动或关闭，而不是单独起

25、作用。 第六十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月l-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。第六十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体第六十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月插入型载体 (小于10kb)gt11第六十五张，PPT共二百三十二页

26、，创作于2022年6月 取代型载体（20kb)第六十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月l-DNA载体的构建：加装选择标记 与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容比如插入型l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记第六十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月加装选择标记 imm434（噬菌体434免疫区段）Imm434 基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑； 当外源DNA插入到标记基因中

27、，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。第六十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月加装选择标记 lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物； 而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑。第六十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月取代型载体 Spi（sensitive to P2 interference）筛选： 野生型噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coil的生长会受到限制的表型，即对P2噬菌体的干扰敏感。（这种生长抑制作用是受噬菌体red和gam这两个基因编码的产

28、物控制的)。如果噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，则可以在P2溶原性E.coil中生长良好。 因此，通过噬菌体载体DNA上的red和/或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶原性细菌鉴别重组和非重组噬菌体。第七十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 R. Young和R. Davis设计的gt10和gt11是噬菌体克隆载体，可用于构建cDNA文库。一方面它们具有较高的克隆效率，1 ng cDNA可产生5000个克隆，另一方面又可容纳较大分子量的外源DNA片段。 因为筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更方便，因此gt10和gt11类载体在构建文库时优于质粒载体pBR322

29、。第七十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 gt10为43.3kb，在它的阻遏基因c I 中有唯一的EcoR I位点， cDNA插入到gt10中可使噬菌体阻碍物基因（c I）失活。 外源cDNA片段（9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。第一百四十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。复性方法：稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。膜分离法除变性剂 透

30、析、超滤、电渗析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析 P64-3） 目标蛋白的复性第一百四十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月149包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）第一百四十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为6mol/L盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性

31、缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）第一百五十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月（1）O-糖基化（Ser, Thr）蛋白质糖基化增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。糖基3 蛋白质不能糖基化第一百五十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖第一百五十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 因没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像

32、折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性。第一百五十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月核糖体内质网高尔基体细胞膜合成肽链折叠、组装糖基化运输浓缩加工运输外排线粒体供能第一百五十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月翻译后加工一级结构的修饰:N-端Met(fMet)去除二硫键的形成个别氨基酸的修饰蛋白质前体中不必要肽段的切除多蛋白的加工羟化作用:羟脯氨酸 羟赖氨酸酶活性中心的磷酸化分泌性蛋白一条合成后的多肽链经加工产生多种不同活性的蛋白质/多肽第一百五十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月信号肽颗粒识别、结合胞浆 带有信号肽的分泌蛋白粗面内质网通道识别信号

33、肽酶切除信号肽肽链合并高尔基体进一步加工分泌出胞外带有信号肽的分泌性蛋白的加工、分泌的过程第一百五十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月第一百五十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月胰岛素的加工过程第一百五十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月多蛋白的加工 一条合成后的多肽链经加工产生多种不同活性的蛋白质/多肽第一百五十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月4 产物蛋白质 N 端多余一个甲硫氨酸残基，易引起免疫反应。 5 细胞周质内含有种类繁多的内毒素，其内毒素很难除去。 6 没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而

34、不能表达真核的基因组基因。第一百六十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 枯草芽胞杆菌 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。第一百六十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 链霉菌 作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。第一百六十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月大肠杆菌中的基因表达第一百六十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：载体能够独立复制。应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。第一百六

35、十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月松弛型复制 pBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆 第一百六十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ第一百六十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。第一百六十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月应具有很强的终止子，只转录克隆的基因

36、，所产生的mRNA较为稳定。所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。第一百六十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；

37、 SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5 端若干密码子的碱基序列 第一百六十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 pBV220是我国科学工用者自己构建的表达载体，使用了很强的PRPL双启动子，含有编码温度敏感性阻遏蛋白的cI857基因(在30-32时产生的阻遏蛋白能阻止PRPL的转录起始，细菌可以正常生长繁殖，42 时该阻遏蛋白发生构像变化而失活，基因开始转录而表达。) 常用表达载体 pBV220系统质粒pBV220的结构第一百七十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月pBV220系统国内使用最多的载体,其组成:来源于pUC8多克隆位点核糖体rrnB基

38、因终止信号pBR322第42253735位pUC18第2066680位噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子pRC23的PL启动子及SD序列第一百七十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 pBV220系统优点：1 PR和PL启动子串联，可以增强启动作用；2 强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；第一百七十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月3.SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；4 整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因； 第一百七十三张，PPT共二百三十二页，创

39、作于2022年6月 5 cIts857抑制子基因与PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。 本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%30%； 本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要。 产物以包含体形式存在。第一百七十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。 该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白的切

40、点，具有与IgG结合的活性，可方便的在分离中用固定化的IgG进行亲和层析，简化下游处理工艺。融合表达质粒pBG-2的结构第一百七十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月真核基因在大肠杆菌中的表达形式（1）以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏。第一百七十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月（2）以融合蛋白的形式表达药物基因 除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达

41、。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。 在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。 第一百七十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月以融合形式表达目的蛋白的优缺点:目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该

42、工段第一百七十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月融合蛋白表达质粒的构建原则：1.能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。2.外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件。第一百七十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月3.两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架4.两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺第一百八十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 通过在DNA水平

43、上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。第一百八十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月目的蛋白的回收 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种： 化学断裂法 酶促裂解法 第一百八十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨

44、内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段，其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。化学断裂法：第一百八十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 这一方法的优点是回收率高（可达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。 然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。第一百八十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月启动子受体基因接头目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-

45、gly-Arg表达亲和层析酶解回收酶促裂解法凝血酶，肠激酶等第一百八十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月人胰岛素分子第一百八十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月人胰岛素在大肠杆菌中的表达溴化氰Cyanogen bromide：第一百八十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 分泌型表达蛋白药物基因 关键的编码分泌信号肽基因取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基因）。 优点：在周质中稳定，有活性，不 含甲硫氨酸残基； 缺点：产量不高。第一百八十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽(ompa)编码序列重

46、组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去。第一百八十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月蛋白质的分泌机制原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感 第一百九十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月重组大肠杆菌 -目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表达系统构建有些G- 能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中 , 这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白 , 它激活定位于内膜上的

47、磷酸酯酶 , 导致细菌内外膜的通透性增大。将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化受体细胞完全分泌型受体细胞转化bacteriocin第一百九十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。 外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。第一百九十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形

48、式： 即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中； 或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。 第一百九十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于： 外源基因的拷贝数 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目，增加表达效率。 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。第一百九十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 外源基因的表达效率 启动子的强弱 转译起始序列对表达效率的影响 SD序列和起始密码ATG的间距 密码子组成 核糖体接合位点的有效性

49、：消除 核糖体及其附近的潜在二级结构第一百九十五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月5-TTGACA-35-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）1. 启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶 亚基的识别位点（1）一致顺序第一百九十六张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月（3）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（2） -35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACATATAAT一致顺序lactrpPLrecAtac Itac II5-TTTACATATGTT5-TTGACATTAACT5-TTGA

50、CAGATACT5-TTGATATATAAT5-TTGACATATAAT5-TTGACATTTAAT-35box-10box第一百九十七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月RNA聚合酶同启动子结合的区域称为启动子区。将各种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，用DNase水解DNA，最后得到与RNA聚合酶结合而未被水解的DNA片段，这些片段有一个由5个核苷酸(TATAA)组成的共同序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框(Pribnowbox)，这个框的中央位于起点上游10bp处，所以又称-10序列(-10 sequence)，后来在-35 bp处又找到另一个共同序列(TTGACA)

51、。离开共同顺序较远的启动子的活性亦较弱第一百九十八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 Hogness等在真核基因中又发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于-25-30 bp处的TATAAAAG，也称TATA框(TATAbox)。TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)或上游激活序列(uptreamactivatingsequence，UAS)。另外在-70-78 bp处还有一段共同序列CCAAT，称为CAAT框(CAAT box)第一百九十九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月基因转录起始位点上游序列的

52、比较TTGACATATAATPuPy-35区-30-70正调控区-20负调控区+1-10区GC区.CAAT区TATAAA T PuAPy-40-110+1-20-30增强子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCT T A原核真核第二百张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月除了必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。还应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。最佳启动子必须具备的条件第二百零一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。32C:42C:cI857阻遏物失活，PL启

53、动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。cI857PL外源基因POPL启动子是温度诱导型第二百零二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。无IPTG:阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。有IPTG:阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。lac启动子是药物诱导型第二百零三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月来自大肠杆菌的乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。PlacO目的基因乳糖启动子lac第二百零四张，PPT共二

54、百三十二页，创作于2022年6月Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacARNA聚合酶基底水平转录 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA第二百零五张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月5-AGGAGGU-3S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）, 翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2. 转译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列？第二百零六

55、张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月AUG左侧的三个碱基也有影响。（2）起始密码AUG-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。第二百零七张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月3. 启动子与外源基因之间的距离第二百零八张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月核糖体结合位点（ RBS）Shine-Dalgarno（SD） sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG16S rRNA3UCCUCCAS-D序列距离

56、AUG的距离也影响翻译第二百零九张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量 在富含 AT 的生物（如单链 DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第三位上的 U 和 A 出现的频率较高； 在 GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有 G 或 C 的简并密码子占 90% 以上的绝对优势4 生物体对密码子的偏爱性第二百一十张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 表达产物的稳定性 表达的外源基因，其产物会受到宿主细胞内降解该蛋白质的酶的作用，使得实际

57、产量很低。 可采用下列方法来提高表达产物的稳定性：1.组建融合基因，产生融合蛋白；2.利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；3.采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；4.选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。 第二百一十一张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月细胞代谢负荷 外源基因在宿主细胞内的大量表达，必然会影响宿主细胞正常的生长代谢，有些产物对宿主还会有毒害作用，将细胞杀死。 可以采取将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段的方法，即当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的表

58、达，使表达产物不会影响细胞的正常生长，当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷。 另外，将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开，当宿主细胞迅速生长时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数。第二百一十二张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月 工程菌的培养条件 优化培养条件使外源基因大量表达。 第二百一十三张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月选择强启动子序列，如tac 等提高表达水平常用的方法2. 调整S-D序列与AUG碱的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。3. 改变起始密码下面的几组密码子一般为5-9bp。能提高翻译的起始效率。第二百一十四张，PPT共二百三十二页，创作于2022年6月4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性5. 减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表