控制菌检查彩片仅供参考

1、控制菌检查药品控制菌检查包括：大肠杆菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。 规定不得检出。控制菌的检查方法须根椐待检菌的特性进行。取供试液（1:10）10ml 相当于供试品1g、1ml、10 cm2。直接或处理后接种，经增菌培养、分离培养后，进行革兰染色、生化试验与血清学鉴定等项检查来确定。1第一章大肠杆菌检查法 一、 简述大肠杆菌即大肠埃希菌，是人和温血动物肠道内的栖居菌随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌表明该样品受到人和温血动物的粪便污染。大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌。 2000年版中国药典规定检

2、验大肠杆菌方法为MUGI 法，即用4甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）和靛基质试验检查大肠杆菌。这是一项新技术。2 原理：实验证明 96 %的大肠杆菌含-葡糖苷酸酶（-glucuronidase, GUD）， 约10 %的沙门菌属一些菌种也含此酶。MUG 被GUD 水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍易于观察，没有主观性，因而用MUG 鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。 单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6 % ，鉴于98 %的大肠杆菌靛基质实验为阳性，故将MUG-靛基质实验结合，用EMB 琼脂平板分离，辅以I MViC实验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达9

3、9 % 。本法的检验周期短。 32、检验步骤: 供试液 增菌培养接MUG靛基质分离培养革兰染色镜检生化鉴定。 4 二、检验程序 供试品 供试液 1：10 BL增菌培养液 分离培养 361 1824h 无菌落生长 MUG 蛋白胨 EMB或麦康凯琼脂平板 第二次报告 361 5、24 h 靛基质 361 1824h第一次报告 MUG 阳性、靛基质阳性： 疑似菌落 MUG 阴性、靛基质阴性： 纯培养 ： MUG 阳性、靛基质阴性： 361 1824h MUG 阴性、靛基质阳性： 革兰染色、生化试验 361 2448 h 报告 （10 ml）5 三、对照用菌液的制备 药典规定的阳性对照试验是必须做的。

4、阳性对照菌须加入供试液中与供试品检验同时进行平行试验。制备：临用前用接种环取大肠杆菌 CMCC （B）44102 的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至灭菌的营养肉汤培养基中（5ml / 支），36 培养18 24h。（把它定为浓菌液）再按10倍系列稀释，取1ml营养肉汤菌悬液（浓菌液），加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-2 以此类推，最终稀释到含活菌数在 50 100 个/ml，同时用营养琼脂平板计数。6对照菌液的制备在专用的超净台7 四、供试液制备 一般性供试品的供试液制备见菌落计数：抑菌性供

5、试品的供试液制备： （在试验中，按常规检查法加入规定量的对照菌，不能检出时，该项控制菌检验结果无效，须认真研究原因，重点考虑药品的抑菌作用并制定灭活处理方法。） 1、稀释法： 又叫扩大培养基法 取规定量的供试品种入较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。 适用于：抑菌作用不强的各类中西药品82、离心沉淀集菌法 取规定量的供试液（1：10取10ml）于无菌刻度离心管中，3000 r / min 离心30 min，移去上清液，留底部集菌液约2 ml ，并稀释该供试液至原规定量。如有不溶性药渣，可先以500r / min 离心5min ，取全部上层液，再按上述方法集菌处理。适用于：抑

6、菌作用不强的各类中西药品。（固体制剂及液体制剂）9 3、薄膜过滤法 取规定量的供试液（1：10液20ml）于稀释剂200ml 中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50 mm 、孔径不大于0.45 0.02 m 微孔滤膜的过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100 ml,一般冲洗3次，抽干取出滤膜，剪成2半分别加入样品和阳性对照增菌培养基中进行增菌。适用于：液体、乳剂、或通过离心可除去不溶性药渣取其溶液的固体制剂。如：大败毒胶囊含有动物类药材控制菌检查大肠杆菌、沙门菌。用离心沉淀集菌法（一次低速离心）加薄膜过滤法，阳性对照正常检出。 10 薄膜过滤11 4、中和法 又称灭活法。 在供试液中

7、加入相应的中和剂以减除供试品中抑菌成分的作用。如： 含1 % 对氨基苯甲酸约15 ml 的BL增菌液（100 ml）用于磺胺类药物。 5、 沉降法 取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中。 本法适用于难溶于水的抗菌制剂。12 五、增菌培养 1、增菌培养基： 胆盐乳糖培养基 （BL） 分装成100ml / 瓶 121高压灭菌20min备用。 （药品中污染的控制菌数量少、分布不均，且多受药物影响呈亚致死状态，适宜的增菌培养方法和高灵敏度的培养基是提高阳性检出率的关键。）2、增菌目的： 使细菌在其生长繁殖，利于进一步分离和鉴 定，称之为增菌培养。13 3、方法： 取灭菌的胆盐

8、乳糖培养基 3瓶 （100ml / 瓶）第一瓶： 加供试液 10ml+ 对照菌液1ml (约含菌50100个) (1:10) 为阳性对照. 第二瓶： 加 供试液 10ml (1:10) 为供试品 第三瓶： 加0.9%无菌氯化钠溶液10ml 为阴性对照.以上三瓶置 37 培养 1824h (必要时可延至48 h )。阴性对照 应无菌生长。14用薄膜过滤法处理后进行增菌15 六、接种MUG靛基质1、摇匀上述BL 增菌培养液，以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液各0.2 ml ，分别加入MUG蛋白胨培养基管（5ml / 支）524h后，将各管置365nm紫外灯下

9、观察有无蓝白色荧光，然后加靛基质试液4-5滴，观察液面颜色。2、观察标准：(前提是阳性对照阴性对照反应正常) MUG 阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）, 报告检出大肠杆菌。 MUG 阴性（无荧光）、靛基质阴性（试剂本色）， 报告未检出大肠杆菌。 16 MUG 靛基质 阳性 阴性 阴性 阳性17 七、 分离培养 （样品中有时除致病菌外，尚有正常寄生菌的存在，因此需将样品接种于固体培养基上，多需用选择性培养基，适于致病菌生长。经培养后，将样品中致病菌分离出来，称为分离培养。）1、培养基：曙红亚甲蓝琼脂（EMB）平板。2、如供试品MUG 阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品

10、BL 增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB 琼脂平板上，培养18 24 h ，观察EMB 有无可疑大肠杆菌菌落生长。3、当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于表1 所列特征，可判为供试品1g或1ml 未检出大肠杆菌18曙红亚甲蓝琼脂（EMB）成分：营养琼脂培养基、 乳糖、 曙红钠指示 剂、亚甲蓝指示剂。用途：分离肠道致病菌 说明：曙红钠与亚甲蓝在培养基中起指示剂作用。如大肠杆菌分解乳糖产酸使pH降低，致使曙红与亚甲蓝相结合呈紫黑色或紫红色化合物，故菌落成紫黑色或紫红色，且有金属光泽。在碱性环境中，曙红、亚甲蓝不能相结合，（故不分解乳糖的

11、细菌菌落为无色。） 曙红钠与亚甲蓝有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。 19 表1 大肠杆菌菌落形态培养基 菌 落 形 态 曙红亚甲蓝琼脂（EMB） 典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽 20在曙红亚甲蓝琼脂（EMB）平板上菌落形态21 八、纯培养（将分离到的可疑菌落，移种于琼脂斜面上，以便获得该菌的纯培养。移种时应注意挑选单个菌落，否则会带有杂菌而得不到纯培养）1、 培养基：营养琼脂斜面2、挑选23 个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18 24 h 。3、用于：做革兰染色、镜检、IMViC

12、 生化试验。 22 九、革兰染色、镜检1、 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，与载玻片上无菌水混合，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰23次（载玻片不烫手）固定。2、 滴加结晶紫染液，染色1min ，水洗。3、 滴加碘液，染1min ，水洗，以滤纸吸干余水。4、 滴加 95 % 乙醇，脱色 20 30 秒，水洗。5、 滴加沙黄染液，复染 1 min ，水洗， 待干后， 镜检。236、染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠杆菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。7、 革兰染色注意事项（1） 玻片必须洁净，涂片菌量亦少，菌不可浓

13、，可用接种针取菌。（2） 培养物的菌龄以1624h为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易染成红色。（3） 脱色是关键，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。 24 十、结果判断前提： 当阴性对照呈阴性，阳性对照 呈阳性：1、供试品MUG阳性、靛基质阳性 报告检出大肠杆菌。2、供试品MUG阴性、靛基质阴性 报告未检出大肠杆菌。3、供试品MUG阳性、靛基质阴性、或MUG阴性、靛基质阳性，EMB平板无菌落生长判未检出大肠杆菌。254、供试品MUG阳性、靛基质阴性、IMViC 试验为 、革兰阴性杆菌，检出大肠杆菌。5、供试品MUG阴性、靛基质阳性、IMViC 试验为 、革兰阴性杆菌，检出大肠

14、杆菌。6、 供试品培养物检查不符合 4、5 二项中的任一项，报告1g 或1ml 供试品未检出大肠杆菌。7、 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不能出检验报告。 26 十一、注意事项结果观察：取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在365 nm 紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。阳性对照菌液的制备、记数及加入含供试品的培养基中等操作不能在检测供试品的无菌室或净化台上进行，以免污染供试品及操作环境。在各类供试品中检测大肠杆菌及其它控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。检出的大肠杆菌及其它控制菌培养物须保留1个月，备用。27 第二章

15、、沙门菌检查法 一、概述沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌，包括常见的伤寒、甲型副伤寒、乙型副伤寒、丙型副伤寒、鼠伤寒，猪霍乱等沙门菌在内。药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准，即对每g（或ml）药品中是否检出沙门菌做出检验报告。标准规定，不得检出沙门菌。28药品中污染的沙门菌可受到损伤或呈休眠状态，故须在增菌培养前先进行预增菌，然后再进行增菌、分离、三糖铁琼脂初步鉴别、生化试验、血清学试验等检验步骤。本方法适用于：含动物组织来源（包括提取物）及动物类原药材粉（动物角、蜂蜜、王浆、阿胶除外）的口服制剂 。 如：中成药制剂中含有麝香、鸡内金、蜈蚣、牛胆粉、豹骨等等复方制剂。都要检沙门菌。 29二、检

16、验步骤： 供试品 供试液 预增菌（营养肉汤） 361 1824h 增菌（四硫磺酸钠亮绿培养基 361 1824h （强）SS琼脂 EMB 琼脂 （弱） 361 1824h 无疑似菌落报告 30三 糖 铁 琼 脂 斜 面营养琼脂氰化钾试验血清学凝集试验靛基质试验尿素酶试验赖氨酸脱梭酶半固体营养琼脂革兰染色镜检报告361 1824h报告31 三、预增菌 1、预增菌意义：修复受损的细菌。 （药品中污染的沙门菌，因受到加温、冷冻等加工过程的影响，细菌受到不同程度的损伤，称为亚致死损伤，如果将细菌直接进行增菌培养，往往不易得到阳性结果，故在增菌培养前，将供试品接种在无选择性增菌培养基中培养，使受损的细菌

17、得以修复，然后再转种至增菌培养基中。）2、培养基：营养肉汤培养基。3、方法：操作同大肠埃希氏菌增菌。4、对照菌：乙型副伤寒沙门菌 CMCC（B）50094 5、培养1824 h 后观察。 32 用薄膜过滤法处理后进行预增菌33 四、增菌培养1、增菌培养目的：使沙门菌属以外的细菌（如：大肠埃希氏菌）受到抑制，使沙门菌属得到一定的增殖。2、增菌培养基： 四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB）10 ml / 支。3、配制： 各成分混合，加热溶解、分装每支10ml 。分装时应随时振摇，使其中碳酸钙均匀地分装到各试管中。121灭菌20min。（为基础液） 备用。临用前每支基础液中加入碘溶液 0.2ml约4滴、加

18、0.1%亮绿溶液0.1ml 约2滴，混匀。 344、方法： 轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照培养瓶，分别吸取1 ml 接种于各1管已加入碘溶液和亮绿试液的四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养1824h。 阳性对照管应呈现混浊。四硫磺酸钠亮绿培养基和基础液35 四硫磺酸钠亮绿培养基 成分： 蛋白胨、硫代硫酸钠、胆盐、碳酸钙。 临用前每支基础液中加入碘溶液 0.2ml 约4滴、加0.1%亮绿溶液0.1ml 约2滴， 混匀。 说明：（碘可氧化硫代硫酸钠而形成四硫磺酸钠。对大肠杆菌有抑制作用，胆盐也有抑菌作用，对痢疾杆菌也有一定抑制作用，而有利于沙门氏菌的生长。碳酸钙有缓冲作用，可使沙门氏菌不至于因培养液酸

19、碱度改变而死亡。亮绿为抑菌剂 （见ss培养基） 36第一步： 碘溶液 0.2m、亮绿试液0.1ml 四硫磺酸钠亮绿培养基 (基础液) 第二步： 供试品预增菌培养液1 ml （或阳性对照预增菌培养液）37 五、分离培养 1、分离培养基： 强选择性的：沙门、志贺菌属琼脂（SS） 中等选择性：胆盐硫乳琼脂（DHL） 弱选择性的：曙红亚甲蓝琼脂（EMB）（选择性培养基中除含有抑制非肠道致病菌的成分外，主要借助于指示系统，使沙门菌等肠道致病菌与其它非致病菌区别开来。进行分离培养时，常将选择性强、弱的培养基联合使用，有助于提高分离效果。一般强弱各用一个。）2、 方法： 轻微摇动供试品增菌培养瓶和阳性对照增

20、菌培养瓶，以接种环分别沾取12 环培养液划线于沙门菌志贺菌琼脂（SS ）平板及曙红亚甲蓝（EMB）琼脂平板各1个，倒置培养2448 h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落 。38沙门菌在SS平板上的菌落形态39沙门菌在EMB平板上的菌落形态40SS 琼脂平板成分：硫代硫酸钠、牛肉浸出粉、乳糖、中性红指示剂、 亮绿试液、牛胆盐、枸橼酸钠、枸橼酸铁铵、琼脂、水。用途：分离沙门氏杆菌说明：其作用可分为a 营养物：如牛肉浸出粉、胨。b 抑制剂：如亮绿试液、牛胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠 等抑制病原菌的生长。C 促进目的菌生长的物质：胆盐既为抑制剂又能促进病原菌的生长。D 鉴别用糖： 乳糖。E 指示剂：中性红。

21、解释：为选择性培养基，借助于指示系统，分离沙门菌。41第一套指示系统为：糖发酵反应区别大肠杆菌、沙门菌。大肠杆菌能分解乳糖，而多数病原菌不分解乳糖，本培养基利用这一特性来初步鉴别肠道内的病原菌与非病原菌。大肠杆菌分解乳糖产酸，通过中性红指示剂呈红色菌落，同时由于与胆盐相结合成胆酸而发生沉淀，故菌落中心混浊。沙门氏及痢疾杆菌属不分解乳糖而分解蛋白质产生碱性物质，故成现透明微黄色菌落。第二套指示系统为：H2S反应：枸橼酸铁能使产生硫化氢的细菌菌落中心成黑色，硫代硫酸钠有缓和胆盐对痢疾杆菌及沙门氏菌的有害作用，并能中和亮绿和中性红染料的毒性。423、沙门菌在分离平板上的菌落特征：（1）沙门菌不发酵乳

22、糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，（2）多数沙门菌因产生H2S ，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，分离沙门菌，应以出现单个疑似菌落为准，否则应以重新分离。阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分后再行检查。43 平 板 沙门菌属亚属 沙门菌属亚属 沙门、志贺菌属琼脂 （S S）无色微带粉红色，透明或半透明，边缘整齐、光滑、中等大小或较小、产H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上带有多数菌落无黑色中心 同胆盐硫乳琼脂平板，但发酵乳糖无黑色中心的菌落与大肠埃希菌不能区别 曙红亚甲蓝琼脂 （EMB） 无色或微带橙

23、色，透明或半透明、中等大小边缘整齐、光滑、 发酵乳糖的菌株菌落为紫色。，迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属同。 沙门菌的菌落特征444、第一次判断： 如阳性对照平板呈现阳性菌落时，供试品平板无菌落生长或无疑似菌落生长，则可判为未检出沙门菌。 当供试品平板生长有可疑菌落时进行下面试验。 45 六、初步鉴别试验1、鉴别培养基： 三糖铁琼脂斜面 TSI （为半固体培养基）（1）成分：胨、 硫酸亚铁、牛肉浸出粉、硫代硫酸钠、乳糖、蔗糖、葡萄糖、氯化钠、酚磺指示液、琼脂、水。 （2）配制注意：配制后分装于11100试管中高压灭菌后，趁热取出立即摆成使其斜面底部不少于23，即高底层短斜面。 46（

24、3）三糖铁琼脂斜面 TSI本培养基含二套指示系统，检查糖类发酵和H2S 产生情况。第一套指示系统乳糖，蔗糖，葡萄糖，以酚红为指示剂。可以出现两种情况：a当待检菌发酵乳糖、或蔗糖时，产酸量较多使整个培养基底层及斜面均呈黄色（乳糖、蔗糖与葡萄糖的比例为10：1） b 当代检菌仅发酵葡萄糖时，产酸量较少， 斜面细菌分解蛋白胨放氨红色 底层因氧压低仍保持酸性黄色第二套指示系统：硫酸亚铁，硫代硫酸钠与H2S反应产 H2S的细菌使硫代硫酸钠分解，产生的H2S与Fe2形成硫酸亚铁不溶性黑色沉淀（硫化铁）。反应需在较为厌氧的条件下进行，故观察到的黑色反应在培养基底层。472 、接种从每一个供试品的分离平板上挑

25、取23 个疑似菌落分别接种于三糖铁琼脂斜面。接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于斜面并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养242 h ，观察结果。（观察反应的时间不能提前或推迟，否则均可引起判断错误）。483、观察现象： （1）观察动力：（在琼脂底层，一般单取一支培养基穿刺作动力）有动力的细菌生长，由穿刺线扩展到整个底层，使培养基变浊。无动力的细菌则仅沿穿刺线生长，形成一条清晰的生长线。（2） 观察气体：如果产生气体，可使琼脂层出现气泡甚至断裂现象。（3）观察颜色：底层和斜面颜色变化。 49产生气体、颜色的变化504、疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为： 斜面红色底层

26、黑色（产H2S ）并显示黄色（产酸）； 斜面红色，底层黄色； 斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。沙门菌仅发酵葡萄糖，均不发酵乳糖及蔗糖，90%以上的沙门菌产生H2S。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂 。51525、第二次判断： 对在三糖铁琼脂斜面未见红色、底层未见黄色，可判未检出沙门菌。 当供试品平板生长有可疑菌落时进行下面试验： 生化试验(靛基质试验、脲酶试验、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验、动力试验) 血清学凝集试验 革兰染色，镜检沙门菌应为革兰阴性杆菌。53 七、结果判断第一次判断 分离培养后，见五(4)。第二次判断 初步鉴别试验(三糖铁琼脂培养基)后，见六(

27、5)。第三次判断 生化试验后按规定报告。54反映类型底层斜面气体H2s可 能 菌 属1普通变形杆菌，枸橼酸杆菌属、亚利桑那沙门菌2埃希菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、枸橼酸杆菌属3沙雷菌属、埃希菌属肠球菌4普通变形杆菌5产碱杆菌、假单胞菌属6沙门菌属7沙门菌属、奇异变形杆菌，爱德华菌属、普通变形杆菌枸橼酸杆菌属8沙门菌属、摩根氏变形杆菌、普洛菲登斯菌属9志贺菌属、沙门菌属、雷极变形杆菌、埃希菌属沙门菌及其它细菌在TSI斜面上的反应55 第三章、铜绿假单胞菌检查法 一、概述1、铜绿假单胞菌，习称绿脓杆菌，为假单胞菌属种，广泛分布在土壤，水及空气，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生

28、产的各个环节污染药品。 2、本法适用于外用药品及一般滴眼剂、眼膏剂的检查。如软膏剂、气雾剂、膜剂等并规定不得检出。563、对照用菌铜绿假单胞菌CMCC（B）10104 见大肠杆菌菌液制备。4、供试液制备：见大肠杆菌 外用软膏、眼膏、取量常为5g,加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml，配制后浓度为1:20, 增菌试验时要取20ml, (相当于供试品1g或1ml)，这一点很重要。5、按增菌分离纯培养革兰染色镜检及生化试验等步骤进行检验。57 二、增菌培养 1、增菌培养基：胆盐乳糖培养基（BL）100ml / 瓶2、增菌目的 ：见大肠杆菌3、方法：同大肠杆菌，对照菌液是 铜绿假单胞菌（有抑菌作用的供

29、试品：要采用适当的方法消除抑菌作用后再增菌,以保证检验。）4、培养现象：在BL 培养基中，如有铜绿假单胞菌生长，培养基液面多有一层薄菌膜，培养液常呈绿色或蓝绿色。58 三、分离培养 1、分离培养基： 溴化十六烷基三甲胺琼脂平板 2、培养基特点：溴化十六烷基三甲胺琼脂平板选择性强，大肠埃希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。3、方法：同大肠埃希菌 59 四、菌落形态： 典型菌落为扁平、圆形或无定形、光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性篮绿色素扩散，使培养基显篮绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选。60 五、第一次报告 当阳

30、性对照平板呈典型菌落生长时，供试品平板无菌落生长或无疑似菌落生长，可判未检出铜绿假单胞菌。当阳性对照平板无菌落生长或生长菌落经检查不是铜绿假单胞菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液。当供试品分离平板生长菌落与铜绿假单胞菌特征相似，即典型或呈疑似菌落时，应挑选该菌落纯培养。61 六、纯 培 养 1、 培养基： 营养琼脂斜面：2、方法：同大肠埃希菌， 此培养物可以做以下检查： 1、革兰染色、镜检铜绿假单胞菌为革兰阴 性无芽孢杆菌。单个、 成对或呈短链排列。 2、生化试验氧化酶试验、绿脓菌素试验、（当绿脓菌素试验阴性时进行如下试验：硝酸盐还原产气试验、42生长试验、 明胶液化试验)62 氧化酶试

31、验： 未滴试药之前培养物是黄色 滴试药后30秒内出现粉红色 阳性反应： 63 绿脓菌素试验：绿脓菌素培养基斜面 搅碎的培养基加入氯仿 阳性反应64 七、结果判断1 见第一次报告。2 供试品如证实为非革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性、均可判为未检出铜绿假单胞菌。否则应进行绿脓菌素试验。3 当绿脓菌素试验的阴性对照试验呈阴性时，绿脓菌素试验呈阳性，并为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阳性，可判检出铜绿假单胞菌。4 当绿脓菌素试验阴性时，应取培养物做硝酸 盐还原产气试验、42生长试验、及明胶液化试验均为阳性时应判检出铜绿假单胞菌。65分离平板未检出报告分离平板可疑G染色、氧化酶试验： 非阴性 阴性未检出 阴性杆

32、菌 阳性做绿脓菌素试验 阳性报告检出 阴性 42 生长、硝酸盐还原产生 明胶液化 + + + 报告检出66第四章、金黄色葡萄球菌检查法 一、概述1、金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属中的一种，广泛分布于自然界、空气、土壤、水及物品上。人和动物皮肤与外界相同的腔道中，也常有本菌存在 。是人类化脓性感染中最重要的病原菌。因此，在外用药及一般滴眼剂中规定不得检出金黄色葡萄球菌。2、本方法适用于：外用药及一般滴眼剂、眼膏剂、滴鼻剂、气雾剂、膜剂等的检查。3、对照用菌液的制备：同大肠杆菌菌液制备。 对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC（B）260034、供试液制备：同铜绿假单胞菌。67 金黄色葡萄球菌检验流程： 供

33、试品 供试液 增菌 营养肉汤 361 1824h分离 甘露醇高盐琼脂平板 361 2472h 有疑似菌落生长 无菌落生长 纯培养 营养琼脂斜面 第一次报告 361 1824h 革兰染色、镜检 血浆凝固酶试验 报告 681、增菌培养基：营养肉汤培养基。分装成100ml / 瓶 121高压灭菌20min备用 。2、增菌目的：见大肠杆菌检验。3、方法：见大肠杆菌检验。 阳性对照菌：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003 4、特点：金黄色葡萄球菌在肉汤培养基中培养，生长后浑浊，随之变清，菌体悬浮或沉淀。 二、增菌培养69 三、分离培养 1、分离平板：甘露醇氯化钠琼脂平板。 （含盐7.5%） 2、甘露醇

34、氯化钠琼脂平板特点： 多数致病性葡萄球菌能在含有大量盐分的培养基中生长，并可分解甘露醇使培养基呈淡橙黄色。血浆凝固酶阴性的葡萄球菌、微球菌及大部分革兰氏阴性杆菌在此培养基上不生长。703、方法： 将上述供试品增菌液及阳性对照液轻轻摇匀，用接种环沾取12 环增菌液划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板，置36培养24 72 h。 71培养基菌落形态特征卵黄氯化琼脂平板金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈，菌落直径12mm。 甘露醇氯化 钠琼脂平板金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环，菌落直径0.71mm。 4、金黄色葡萄球菌在两种分离培养基上菌落形态特征72

35、 5、第一次结果判断 当阳性对照平板呈典型菌落生长，供试品分离平板无菌落生长或有菌落生长但不同于上表所列特征，可报告未检出金黄色葡萄球菌。当供试品分离平板生长菌落与上表所列特征相似的典型形态，应挑选该菌落作纯培养。当阳性对照平板未生长或生长菌落经检查不是金黄色葡萄球菌时，应研究原因，重新制备供试液,以消除供试品抑菌成分的影响。选用适宜的方法进行增菌。如薄膜过滤法、离心法、稀释法等。73 四、纯 培 养 1、适用于供试品分离平板生长菌落与上表所列菌落特征相似时，应选取23个菌落分别用接种针轻轻沾取菌落中的表面培养物接种与营养琼脂斜面上，于361培养18 24h。2、 此培养物可用于：革兰染色、镜

36、检及血浆凝固酶试验。74 五、革兰染色、镜检革兰染色：见大肠杆菌检查法 镜检： 金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌无芽孢、排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或链状排列，少数可散在。75 六、血浆凝固酶试验1、原理：某些细菌如金黄色葡萄球菌，产生血浆凝固酶。分泌到菌细胞外，称为游离血浆凝固酶。它能使血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白。试管法血浆凝固酶试验，阳性是由此酶形成。2、 血浆凝固酶试验过程：取试管3支第一支加血浆氯化钠液0.5ml 加供试品的营养肉汤液0.5ml 3624h 凝固 为阳性反应； 血流自如 不凝固 为阴性反应；第二支加血浆氯化钠液0.5ml 加金黄色葡萄球菌的营养肉汤液0.5ml 3624h 凝固 为阳性对照 第三支加血浆氯化钠液0.5ml 加氯化钠溶液 0.5ml 3624h 血流自如 为阴性对照 76 七、结果判断当阴性对照成阴性、阳性对照成阳性时按下列报告： 1 见第一次报告2 革兰染色为阳性球菌、血浆凝固酶试