基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用课件

1、基因工程技术在改进微生物菌种方面的应用主要应用: 1. 提高次级代谢产物的产量 2. 改进代谢产物的组分 3. 改进菌种的生理性能 4. 产生新的代谢产物 (一) 提高次级代谢产物的产量基因工程技术提高抗生素产量的主要手段1. 增加限速酶的基因拷贝数2. 增加正调节基因,去除负调节基因3. 增加抗性基因的拷贝数1. 增加限速酶的基因拷贝数原理： Ea Eb Ec Ed A B C D E ( 代谢产物） 限速酶 Rate-limiting Bottleneck Ea Eb Ec 例1: 起始原料 ACV三肽 异青霉素N 青霉素 -aminoadipic acid L-cysteine Ea:

2、ACV合成酶 Ec:异青霉素N酰基水解酶 L-valine Eb:异青霉素N合成酶 青霉素酰基转移酶 异青霉素N合成酶对P.chrysogenum青霉素产量的影响 菌株 原始菌株 低产菌株 高产菌株 Wis 54-1255 AS-P-78 IPNS 的基 1 - 9-14 因拷贝数 mRNA量 1 - 32-64 青霉素产量 100% 导入带IPNS 140% 的基因片段 增加IPNS基因提高青霉素产量转化青霉素产生菌 Wis54-1255转化菌株青霉素V产量提高40%例2. 头孢菌素C生物合成的限速酶 在头孢菌素C 的工业发酵生产中，人们发现发酵结束后在得到的发酵液中，除了主要产物是头孢菌素

3、C外，在发酵液中还积累另一种产物-青霉素N。 问题：积累中间产物-青霉素N 原因：下一步反应为限速酶反应 解决：导入额外的扩环酶/羟化酶基因 结果：使头孢菌素C的产量提高 25-50%， 积累的青霉素N消失。增加限速酶基因提高头孢菌素C产量转化C.acremonium394-4 转化后菌株头孢菌素C产量提高25-50%增加限速酶的其它例子-3:例3. 十一烷基灵菌红素 产生菌:天蓝色链霉菌 S.colicolorA3(2)acetyl CoA polyketide pathway 氧甲基转移酶S-腺苷甲硫氨酸构建重组质粒(带甲氧基转移酶)转化到氧甲基转移酶缺陷变株 转化菌株十一烷基灵菌红素产量

4、提高5倍增加限速酶的其它例子-4:例4. 泰洛星 (Tylosin) 产生菌:弗氏链霉菌 (S.fradiae)acetyl CoA + malonyl CoA polyketide pathway大菌素（macrocin) 甲氧基转移酶 Tylosin构建重组质粒(带甲氧基转移酶)转化到弗氏链霉菌 (S.fradiae) 转化菌株泰洛星 (Tylosin) 产量显著提高2.增加正调节基因, 去除负调节基因 调节基因根据其作用的不同分为正调节和负调节。正调节促进生物合成结构基因的转录，负调节阻扼结构基因的转录。 将带有正调节基因片段的重组质粒转化到生产菌株中，由于转录功能的增强，使生物合成结构

5、基因得以高水平的表达，提高了代谢产物的产量。 反之，对于负调节基因，通过基因工程的手段，将其祛除或失活，就能解除阻扼作用，同样导致使生物合成结构基因高水平的表达，提高代谢产物的产量。调节基因在次级代谢产物合成中的作用 次级代谢产物生物合成基因簇内的正负调节基因 基因 效应 菌株 次级代谢产物 功 能 brpA 正 吸水链霉菌 Bialaphos 激活bar ( Bialaphos 抗性)基因和 6个bap (生物合成)基因的转录 tylG 正 弗氏链霉菌 泰洛星 激活tyl F( 编码 MOMT) 和其它 tyl 生物合成基因的表达 actII 正 天蓝色链霉菌 放线紫红素 能使act菌株放线

6、紫红素的产 量增加30 40倍 mmy 负 天蓝色链霉菌 次甲霉素 该基因的插入失活导致次甲霉 素过量生产 strR 正 灰色链霉菌 链霉素 调节链霉素的生物合成 . 去除负调节基因使结构基因超量表达Methylenomycin（次甲霉素）次甲霉素是由天蓝色链霉菌产生的抗生素，研究结果表明，次甲霉素是由天蓝色链霉菌携带的质粒SCP I 编码的。在其生物合成结构基因的上游，存在一个负调节基因-mmy。 克隆到质粒上 转化变青链霉菌 转化子 （次甲霉素高产表达）mmy3.增加抗性基因的拷贝数 抗性基因的作用是避免抗生素产生菌被自身产生的代谢产物所杀灭。其作用可通过三条途径实现：1.抗性基因产物(酶

7、)将抗生素作用的底物加以修饰; 2.将抗生素的分子结构加以修饰,使其失活; 3.将抗生素分子排出细胞外。 提高菌种耐受自身产生抗生素的能力是取得高产的前提，此外，将胞内的抗生素排出胞外，还可以解除高浓度代谢产物对其生物合成的反馈调节，使产物大量合成。 将抗生素抗性基因片段连接到适当的质粒上，用得到的重组质粒转化抗生素生产菌株，就可能使抗生素的产量得以提高。 增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量例1. Davies J. 利用链霉菌质粒pIJ702 从卡那霉素产生菌克隆了6-N-氨基糖苷乙酰转移酶AAC6的基因(aacA),该基因产物在乙酰辅酶A的存在下,可将氨基糖苷类抗生素的氨基糖6乙酰化。. 将

8、aacA基因转入新霉素和卡那霉素的产生菌中, 结果显著提高了抗生素的产量. 转化 转化子- 链霉菌细胞 氨基糖苷类抗生素产量提高卡那霉素6-乙酰转移酶AAC（6） 的作用增加抗性基因拷贝提高抗生素的产量-2例2. 螺旋霉素抗性基因srmB 重组质粒 转化 S.ambofaciens（生二素链霉菌） 转化子 使螺旋霉素产量提高。 (二) 改进代谢产物的组分 链霉菌产生的次级代谢产物常常是一组结构相似的混合物。每个化合物称为它的一个组分。多组分产生的分子基础是因为次级代谢产物的合成酶对底物的选择性不强以及合成途径中分支途径的存在。 通过基因工程手段，灭活某分支途径的酶，就可以去除该分之支途径的产物

9、。此策略常用来去除发酵产物中的无用组分，提高有用组分的含量。例一: 阿维菌素产生菌的基因改造阿维菌素“B”组分转化成“A”组分的分子基础阿维菌素“B”组分阿维菌素“A”组分aveDC5-氧甲基转移酶阿维菌素C5位的甲基化 ATP 转甲基酶 aveD“B” 组分“A” 组分OCH3阿维菌素生物合成基因簇1.用基因工程手段灭活C5-氧甲基转移酶基因主要过程：克隆阿维菌素生物合成的aveD基因构建 gene disruption 质粒转化阿维菌素产生菌(S.avermitilis)挑选双交换菌株阳性菌株的发酵发酵产物的组分分析(HPLC, 质谱)Disruption plasmid of aveD

10、gene双交换菌株（阻断变株）的挑选 发酵产物的HPLC分析D24-1组分的质谱分析m/z813M+Na +, D24-1的分子质量为790。与107#菌株发酵液主组分oligmycinA的分子量一致。将两菌株发酵液提取物混合后进样，根据在HPLC分析中D24-1组分和菌株Ave107#的主峰相重合，可以推测D24-1组分为oligmycinA。2. 只产Avermectin “2”组分基因工程菌的构建 aveC 脱水酶阿维菌素“2”组分阿维菌素“1”组分aveC基因在染色体上的位置重组质粒的构建重组质粒的转化转化阿维菌素产生菌tsrR amRtsrR amRGene replacement

11、(基因置换） DBB C am CaveCaveCam tsrR amR aveC+ tsrS amR aveC遗传型的改变 B amaveCamaveC tsrR amR aveC tsrS amR aveC 传几代后，丢掉质粒 基因工程菌AveC9基因工程菌AveC-9发酵产物的HPLC分析例二. 黑暗链霉菌的基因改造 黑暗链霉菌首先是从墨西哥土壤中分离得到的， 1967由美国礼莱公司（Eli Lilly Co.）最初报道了黑暗链霉菌产生的代谢产物-尼拉霉素复合物，它包括1、1、2、3、4、5、5、6、7等15个组分。其中组分2、4、5为尼拉霉素的主组分，其他组分为小组分。组分2为安普霉素

12、（Apramycin），组分4为6”-O-氨甲酰卡那霉素B（6”-O-Carbamoylkanamycin B，CKB），组分5为6”-O-氨甲酰托普霉素（6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）3 七八十年代，我国中科院微生物所与四川抗生素工业研究所先后分离到黑暗链霉菌的新菌株：黑暗链霉菌4107与黑暗链霉菌83-1050B8，它们的组分中含有尼拉霉素组分2、4、5。经过“七五”攻关中筛选到了只产组分2（Apramycin）、5 （6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）的菌株U-1359。黑暗链霉菌（S.tenebrarius）菌株U-135产生的两种主

13、要抗生素妥布霉素(Tobramycin) 妥布霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌（S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组份5 。它对革兰式阴性菌有很高的抗菌活性。特别是对绿脓杆菌有独特的抗菌作用，因此常用来治疗烧伤后的绿脓杆菌感染。 临床上使用的妥布霉素是由黑暗链霉菌经过发酵后，经过树脂吸附，层析后得到中间产物6”-O-氨甲酰托普霉素，然后再将6”-甲酰基水解掉，得到妥布霉素。安普霉素(Apramycin) A brief introduction to apramycin 安普霉素是氨基糖苷类抗生素，它是黑暗链霉菌（S.tenebrarius）产生的尼拉霉素复合物的组份2 。它对革兰式阴性菌和葡萄球菌有很高的抗菌活性。由于分子中具有独特的辛二糖结构，对多种氨基糖苷类抗生素的耐药菌仍有抑制和杀灭作用，与常用的氨基糖苷类抗生素不易产生交叉耐药性。80年代在美国和欧洲安普霉素作为兽用抗生素和饲料添加剂投入市场。我们课题组经过九五攻关，获得了产生安普霉素单一组分的菌株，并把它开发成为二类兽用新药和饲料添加剂。安普霉素/妥布霉素生物合成基因簇的位置 安普霉素生物合成基因簇部分基因妥布霉素生物合成基因簇？ aprA