人类人工染色体的构建策略

1、.：.；人类人工染色体的构建战略摘要： 目前各种运用于基因治疗领域的载体均存在一定的局限性。越来越多的研讨者以为，最理想的基因治疗载体应该在染色体的构造根底上构建，使目的基因整合后可以作为独立的功能单位表达，或者成为游离基因此稳定存在。人类人工染色体human artificial chromosome, HAC的出现，使这种想象成为能够。近年来，研讨者们基于两种根本战略相继构建多种HAC，并以之作为载体进展了一系列外源性基因表达研讨，虽然还有许多问题亟待处理，但并不妨碍人们对之成为理想的基因治疗载体寄予厚望。关键词： 人类人工染色体； 载体； 基因治疗中图分类号： R394实际上讲，理想的基

2、因治疗载体应该完全由天然染色体成分组成，至少具备三个构造要素：复制原点、端粒和着丝粒。当其进入靶细胞后，目的基因可以模拟自然条件下基因表达或者作为游离基因此稳定复制，即可控性表达，这是基因治疗胜利的关键所在。外源性基因进入靶细胞后，假设其表达处于失控形状，将带来严重的后果。最理想的可控性方式是模拟人类基因自然形状下的调控方式，实现这种可控性表达需求目的基因全长或包括上下游的调控区及内含子，这就对载体系统提出了极高的要求，它必需具备数十个kb到几百个kb的包装才干，同时还要思索到反复序列的DNA重排和丧失问题；其次，一个如此长的片段进入细胞内，其整合位点相当重要，最终理想是可以实现定点插入，或者

3、作为一个游离基因表达。传统的基因治疗载体，如逆转录病毒载体、腺病毒载体等，很难到达以上要求，并且存在免疫异源性、插入诱变等许多问题。1 HAC的构建战略人工染色体的想象，为载体研讨提供了新的思绪。这类载体不需求病毒蛋白质衣壳；可以象天然染色体一样以线状或环状存在；同时，在缺乏选择压力的情况下，可以以较低的拷贝数在细胞内稳定存在；有无限的 HYPERLINK bbioo/Search.asp?ModuleName=Article&Field=Title&Keyword=克隆 克隆才干；不但能插入靶基因，还能插入其他的调控元件或特异性细胞靶向元件。基于上述优点，研讨者们对其倾注了不懈的努力。198

4、3年，酵母人工染色体构建胜利，14年后，第一个HAC的胜利构建，被以为是基因治疗载体研讨领域的艰苦突破。以后，研讨者相继构建了各种不同的HAC。目前，构建HAC基于如下两种战略。1 自上而下的战略 该战略是以天然染色体的断裂片段为根底，构建新的HAC。这些断裂片段主要经过以下方法得到：a低剂量辐射;b端粒定位染色体截断技术见图1;c外源性DNA片段定点插入后扩增;d天然染色体有丝分裂过程中自发产生的碎片。研讨者发现，将外源性端粒DNA整合入哺乳动物染色体，可将该染色体截断，同时在断端产生新的端粒。研讨者们运用这种技术修剪哺乳动物染色体，胜利构建了一系列大小在0.56 Mb之间不等HAC。最初，

5、端粒DNA整合的位点是随机的，而如今，研讨者们可以将端粒DNA定点插入染色体中特定的位点。所获得的这些微型染色体在构造上相当稳定。Grimes等1,2将外源性DNA插入小鼠和人类染色体着丝粒区，扩增这些DNA导致染色体裂解为60400 Mb大小的片段，然后纯化这些片段用于显微注射或者脂质体介导的转染以构建HAC。另外，研讨者还利用自然条件下人类染色体有丝分裂产生的碎片hCF，经过微细胞介导染色体转移技术，构建人类微型染色体载体。以上的微型人工染色体中，有相当一部分被证明对小鼠生殖细胞系细胞有高效的转染才干，同时，这些线状HAC的大小和构造已根本清楚，有望作为载体运用于基因治疗。2 自下而上的战

6、略 该战略是在细胞内或者细胞外将着丝粒DNA、端粒DNA以及复制原点装配在一同，从而构建HAC。研讨者运用这种战略，在HT1080细胞中得到了第一种HAC。他们将1 Mb的人17号染色体的卫星DNA、人端粒DNA、人 HYPERLINK bbioo/Search.asp?ModuleName=Article&Field=Title&Keyword=基因组 基因组DNA随机片段用脂质体共转染HT1080细胞。经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点且按照正常染色体构造顺序的重组衔接产物以染色体的方式稳定保管下来，而那些不完好或未按照正常顺序衔接的产物因其不能稳定地进展有丝分裂而丧失、降解。由

7、此经过有丝分裂而自然挑选出HAC。其后，在一样细胞系内，研讨者们将包含卫星DNA和端粒序列的环状或者线状DNA分别引入酵母人工染色体YAC、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体人工染色体PAC中，构建了多种的HAC。它们以较低的拷贝数存在于细胞中，并表现出很高的有丝分裂稳定性。有趣的是，虽然引入了端粒序列，这些重组人工染色体中的绝大多数都呈环状，而并非如预料的那样呈线状构造。最近的研讨证明，运用缺乏端粒DNA序列但包含有70 kb卫星DNA的PAC即可构建出有丝分裂稳定的环状HAC，这一发现有助于人们进一步了解构建HAC所需求的最小功能单位。对这些重组人工染色体进展免疫组化分析，发现了着丝粒蛋白-

8、C和着丝粒蛋白-E的存在。图1 端粒定位染色体截断技术图片暂缺2 HAC载体表达系近年来，研讨者利用上述HAC构建了不同的基因表达系统，获得令人鼓舞的成果。目前，目的基因的插入主要基于如下几种战略：(1)共转染;(2)运用Cre/loxP和FLP-FRT系统进展位点特异性重组;(3)染色体克隆技术3，4。Kuroiwa等将Cre/LoxP介导的位点特异性重组技术同端粒定位染色体截断技术相结合，开展了染色体克隆技术图2，使准确地插入特定染色体区段成为能够。Grimes等5将21号染色体的卫星DNA和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因HPRT全序列引入PAC中，构建了HAC。然后，转染HPRT缺陷细

9、胞，在缺乏选择压力的条件下，HPRT基因可以继续表达60天。还有研讨者构建了一404 kb的HAC，包括人类17号染色体着丝粒卫星DNA序列、人染色体端粒、HPRT基因全序列，将其转染至HPRT缺陷的HT1080细胞，该染色体载体表现出很高的有丝分裂稳定性且目的基因继续表达60天。Auriche等6将囊性纤维化跨膜转导调理因子基因CFTR全序列及其上游调控序列插入HAC中，胜利地检测到了该基因的转录和翻译产物。Ikeno等7将携带三磷酸鸟苷酸环化水解酶基因GCH1全序列包括编码序列和调控区的BAC，与包含卫星DNA序列的BAC共转染，进入人类成纤维细胞内，挑选出携带GCH1基因的HAC克隆，分

10、析结果阐明，这些HAC表现出很高的有丝分裂稳定性，且GCH1程度明显提高，并对IFN-的刺激高度敏感。Kuroiwa等4将包含免疫球蛋白基因Ig位点的hCF导入小鼠，构建了数个转染色体小鼠系，从中挑选出包含有SC20载体是于人类第14号染色体的hCF，其上有Ig重链基因位点的细胞系，然后运用“染色体 HYPERLINK bbioo/Search.asp?ModuleName=Article&Field=Title&Keyword=克隆 克隆技术，使携带目的基因的人类染色体与SC20载体在雏鸡DT40细胞中发生位点特异性同源重组，胜利地构建了只包含特定染色体区域的HAC，这些HAC分别稳定地表达

11、Ig，Ig，Ig以及细胞色素P450，且表现出很高的有丝分裂稳定性。Robl等8也进展了类似的研讨。图片暂缺图2 染色体 HYPERLINK bbioo/Search.asp?ModuleName=Article&Field=Title&Keyword=克隆 克隆技术4这些初步结果阐明，HAC可以稳定地表达体积较大的基因，同传统cDNA载体相比较，在插入目的基因的同时，还能将其上游的调控序列一同整合，而“染色体 HYPERLINK bbioo/Search.asp?ModuleName=Article&Field=Title&Keyword=克隆 克隆技术的出现，使构建只包含特定染色体区域的H

12、AC载体成为能够。3 HAC载体着丝粒的相关研讨着丝粒是HAC载体中一个相当关键的成分。过去以为，卫星DNA是构成着丝粒不可或缺的成分，但最近的研讨结果阐明，并非如此。研讨者发现，从内源性染色体着丝粒分别的染色体片段，发生重排后能构成新着丝粒neocentromere，对其进展序列分析，并无卫星DNA序列的存在，然而这些新染色体同样表现出很高的有丝分裂稳定性。目前，很多这类新着丝粒曾经被定位，大小数百个kb2 Mb不等9。同时，卫星DNA在染色体上的插入并不一定能构成新的着丝粒，比如，染色体发生罗伯逊易位时，其中一个着丝粒失活而丧失构成动粒的才干。又如，在运用“自下而上的战略构建HAC的过程中

13、，插入染色体臂上的外源性卫星DNA，有些只被扩增，而并未构成新的着丝粒。以上景象提示，着丝粒的构成有后生修饰要素参与，染色体组中有决议着丝粒构成的后生修饰标志存在。染色体重排构成的新着丝粒是由于在染色体非着丝粒区获得了后生修饰标志，而卫星DNA不能构成着丝粒，那么是由于决议着丝粒构成的后生修饰标志的丧失。这些后生修饰标志可以提高DNA序列对着丝粒蛋白-ACENP-A、着丝粒特异性组蛋白H3的亲和力，进而构成着丝粒10,11。Nakano等12研讨阐明，运用组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素TSA，能显著添加组蛋白H3的乙酰化程度，添加着丝粒构成后生修饰标志基因的转录程度，从而明显提高外源性卫星DN

14、A构成着丝粒的概率。另外，运用外源性卫星DNA构建的重组HAC在有丝分裂时的稳定性需求进一步评价。最近的研讨结果阐明13，运用外源性卫星DNA构建的重组HAC，其有丝分裂分别错误不分别或者后期延迟的发生率是天然染色体的5倍。4 存在问题与展望存在的问题：1目前对复制起点的性质缺乏深化的了解，由于复制起点在 HYPERLINK bbioo/Search.asp?ModuleName=Article&Field=Title&Keyword=基因组 基因组内出现频率相当高，很容易获得，因此对构建HAC影响不大。不过，如何获得不带有无关或者有害的额外编码序列的复制起点，仍是一个需进一步讨论的问题。2H

15、AC体积很大，用何种方法才干将如此宏大的DNA完好地转入靶细胞，这是一个亟待处理的问题。显微注射、电穿孔及基因枪微粒轰击法能够对如此宏大的HAC呵斥机械损伤，而阳离子脂质体也难以转染600 kb以上的DNA片段，相比较而言，细胞交融是较为真实可行的方法。(3)对着丝粒的研讨有待深化，以确定着丝粒的最小功能单位。目前没有任何一种HAC真正运用基因治疗的临床实验。但是，由于这类载体具有许多突出的优越点，置信在不久的未来，HAC有能够成为人类基因治疗的理想载体。参 考 文 献1Grimes BR et al. Gene Ther， 2002， 9: 7137182Grimes BR et al. M

16、ol Ther， 2002， 5: 7988053Kuroiwa Y et al. Nat Biotechnol， 2000， 18: 108610904Kuroiwa Y et al. Gene Ther， 2002， 9: 7087125Grimes BR et al. EMBO Rep， 2001， 2: 9109146Auriche C et al. EMBO Rep， 2002， 3(9): 8268287Ikeno M et al. Genes Cells， 2002, 7(10): 102110328Robl JM et al. Theriogenology, 2003, 59(1): 1071139Wong