动物免疫学实验技术-SPA技术

1、PAGE PAGE 12 第十六章 SPA技术(Staphylococcal protein A technique)一、概述金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA占整个细胞壁蛋白成分的6.7%，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。SPA的理化性质 SPA是一种蛋白质,由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275n

2、m %=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。其分子量因测定方法不同而有所差异。SPA的部分理化参数见表161。表161 SPA部分理化参数分子量42 000沉降系数S 20w(S )2.10扩散系数D20W(cm2/s)4.3107Stocks半径(nm)5.00摩擦比f/f,min2.10粘度(n) (ml/g)2.90Hggins常数0.66比容V(ml/g)0.72SPA的免疫学性质 SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人

3、、猴、鼠、小鼠及牛；对大白鼠、绵羊的亲和力差；对马、犊牛、山羊等无亲和力；对所有的鱼类、两栖类、爬行类、鸟类（除少数例外）均不能与之结合。鸡的IgG必须与相应的抗原形成复合物才能与SPA结合，原因可能是AgAb复合物改变了IgG的Fc片段的构象。SPA与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。SPA除与IgG结合外，还能与血清中少量的IgM和IgA结合，SPA菌对各类免疫球蛋白的吸附率：IgG为90%98%，IgM为2%30%，IgA为1.5%20%。出现共沉反应的SPA与IgG必须有两个结合部位，它们分别在Fc和Fab段上,缺一虽能与SPA结合，但不出现共沉反应，这种Fab的参与

4、并非SPA抗体反应。现已研究表明，IgG与SPA的结合部位是CH2和CH3的交界处。（三）SPA的生物学特性1免疫原性与过敏原性 SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPAIgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。2抗吞噬作用 由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。3固定补体 SPAIgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动

5、物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。4促有丝分裂因子 SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。5去封闭作用 固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。（四）SPA的应用 SPA应用很广，但所有应用的原理都离不开SPA具有与IgG的Fc段的结合能力，主要应用方面如下：1SPA菌的协同凝集作用用已知的标准血清，吸附到SPA菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶

6、性的。此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要 SPA菌体及粗制免疫血清即可。所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。协同凝集只适用于检测抗原，未见应用于检测抗体的报道。2作为广谱第二抗体 用SPA代替抗体IgG的第二抗体，有如下优点：SPA制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的IgG都能应用,不受种属限制。而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制；SPA的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为103 L/克分子，结合后对IgG的活性无影响。无论在

7、0、37、44及56几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗体在较长的孵育中，出现抗原分解的问题也可以得到解决；SPA容易标上125 I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的Fc受体结合。SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受体影响，所以有较高的抗IgG特异性；用第二抗体做免疫沉淀试验时，必须将抗免疫球蛋白的浓度调整至等价，才能产生最佳的沉淀作用。而用SPA菌沉淀，不受此限制，能保证彻底的沉淀；SPA与lgG结合是可逆的，用4mol/L尿素、4mol/L硫氰酸、盐酸

8、(pH2.5)或鸟嘌呤盐酸盐等都可以使之重新解离。3用于提取纯化IgG 利用SPA与IgG的结合特性提取IgG，比常规采用硫酸铵、Sephadex柱，DEAE柱或免疫梯度离心等法要简便得多，而且纯度好。4检测和提纯IgM IgM在病毒的早期诊断中具有重要意义，为了检测特异性IgM抗体，必须首先在血清中除去IgG。采用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的办法，利用此法也为IgM的提纯开辟了道路。5其它方面 用于免疫复合物的检测、体外激活补体功能试验、细胞表面标记以及肿瘤表面抗原的检测等。（五）标准菌种 目前国内使用的大致如下：1含A蛋白的葡萄球菌菌株 No 1800株：系中国科学院微生物研究所

9、保存的由上海市分离出的菌株，其SPA含量、活性及湿菌体收获量与Cowan 1株相似，且不易出现自凝现象。 Cowan 1株：为SPA丰富的日本引进标准株，中国科学院微生物研究所编号为ASI 1476 799型菌株：从化脓性骨科病人的骨标本中分离出含SPA丰富的菌株。 丹麦1972株：由丹麦引进。2不含SPA的葡萄球菌株 Wood 46株：由日本引进，编号为ASI 1477。 乙5株：遵义医学院保存的SPA菌株。（六）培养基常用的培养基配方如下：配方一 蛋白胨 10.00g葡萄糖 1.00g氯化钠 3.00gNa2HPO412H2O 2.00g牛肉浸液(或5%牛肉膏) 1 000.0ml混合，调

10、pH 7.8欲配固体培养基则另加琼脂25.00g配方二 胰酶消化酪蛋白 17.00g大豆胨 3.00g氯化钠 5.00g葡萄糖 25.00gK2HPO4 25.00g混和，调pH 7.3 配方三 水解蛋白胨 10.00g氯化纳 5.00g牛肉膏 10.00g酵母膏 25.00g色氨酸 5.00mg半胱氨酸 100.00mg琼脂 40.0gH2O pH 7.6 1 000.00ml二、SPA的提取、纯化与鉴定SPA的提取 SPA提取的方法很多，包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。现将常用的方法介绍如下：1煮沸提取法 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上，37培养20h

11、24h。 以0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下，配成10%(V/V)的悬液。 水浴中煮沸1h，迅速冷却至4，4 000r/min离心20min，去沉淀。 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.03.5，然后4 000r/min离心30min。 沉淀以pH5.9PB溶解，然后12 000r/min离心20min。 上清液加4.7倍量的95%酒精，充分混合后，.4 000r/min离心20min。 沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解，12 000r/min离心20min。 上清液即为粗提SPA液。 Sephadex G100过柱，上样后用0.05mol/L p

12、H7.4 PBS液洗脱，流速控制在每管2ml3ml/20min，收集流出液。 测OD275nm值及用对流免疫电泳检测每管的活性，将有活性的各管合并、浓缩或冻干。2溶菌酶消化法 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L TrisHCl缓冲液配成10%15%的悬液。 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1万U/mg蛋白)37水溶搅拌24h。 置4冷却后，以12 000g离心30min。 取上清，调pH值至7.0。 加硫酸铵，边加边搅拌，使溶液呈80%的饱和度，4过夜。 12 000g离心30min。 以少量蒸馏水将沉淀溶解。 透析或过Sephadex G50除盐，即为粗

13、制的SPA制品。（二）SPA的纯化1DEAESephadex A25离子交换层析法 用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液平衡DEAESephadex A25柱。 加样后，用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱12h14h。 改用0.4mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱，流速0.15ml0.2ml/min，收集流出液，测OD275nm。 测SPA活性(以对流免疫电泳)，能与人及猪正常血清产生沉淀线的各管合并。 浓缩或冻干保存。2Sphadex G100凝胶过柱法装柱、加样，以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脱，收集洗脱液，如上法测定活性和蛋白含量。3亲和层析法(1) 猪IgG

14、的制备：取正常猪血清，硫酸铵提取球蛋白，再过DEAE纤维素32柱，制得纯化的IgG，以0.1mol/L NaHCO3液平衡，配成4mg5mg/ml溶液。(2) 偶联：将固体溴化氰1.2g溶于20ml蒸馏水中，倾入容积为15ml的Sepharose4B中，搅拌，同时滴加2mol/L NaOH使pH维持在11.0，反应8min，用500ml预冷的0.1mol/L NaHCO3在2号砂芯漏斗上洗脱已活化的Sepharose4B(在90Sec内洗脱完毕)，迅速加入IgG液15ml，于4缓慢搅拌过夜，次日以PBS充分洗涤，至洗出液OD280nm0.02为止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封

15、闭残余活性基团，再以PBS洗至中性为止。(3) PBS亲和层析：将粗制SPA溶于PBS液中，加入IgGSepharose4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至OD280nm0.02为止，换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸盐酸缓冲液洗脱，流速0.2ml/min，收集洗脱液，即为纯化的SPA，对流电泳检查SPA活性，收集，浓缩，保存。（三）纯化SPA的鉴定用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，只出现一条沉淀带为纯品。据报道，常出现一条杂蛋白染色带。以亲和层析法提纯的纯度高。三、SPA菌协同凝集试验基本原理 由于SPA能与IgG的Fc片段非特异性结合，同时不影响Fab片段的活性,所以当带有SPA的金黄

16、色葡萄球菌与抗体混合，再加入适量的相应抗原，结果会使出现的凝集反应更易于观察。它对颗粒性抗原和可溶性抗原抗体反应都有协同凝集作用。此方法简便、快速、便于推广应用。（二）材料与试剂1金黄色葡萄球菌(1) SPA阳性株：NO.1800株(国内分离株)比Cowan株(国际标准株)更为优越，在加热过程中，不易出现自家凝集，更适用于协同凝集实验。(2) SPA阴性株：Wood 46株。2试用菌种 炭疽杆菌、枯草杆菌及蜡样芽胞杆菌。3炭疽免疫血清。4正常免疫血清。5培养基。60.01Mol/L pH 7.4 PBS液，0.1%NaN3的0.01Mol/L pH7.4 PBS液，0.5%福尔马林的0.01M

17、ol/L pH 7.4 PBS液。7生理盐水。8磁力搅拌器等。（三）操作方法1将N0.1800株接种琼脂斜面培养基上，37培养20h24h。2以少量生理盐水洗下菌体，4 000r/min离心20min。3将沉淀的菌体用0.01mol/L pH7.4 PBS液洗3次，然后用含0.5%福尔马林的0.01mol/L pH 7.4PBS液制成10%(V/V)悬液，置室温下3h。4将悬液56水浴30min，离心，用PBS液洗2次。最后用含0.1%NaN3的PBS液制成10%悬液，即为SPA菌稳定液，置4冰箱备用。5将SPA悬液1ml(如从冰箱拿出，可再用PBS液洗一次)，加灭活的炭疽阳性血清0.1ml，

18、3730min。64 000r/min离心20min，去上清，沉淀用PBS液洗2次，最后用含0.1%NaN3的PBS液制成10%悬液，共10ml，此即为SPA菌的凝集用试剂。7取干净载玻片，用接种环取1滴已标记的SPA凝集用试剂，然后再从琼脂斜面上取少量待试细菌，充分混合，2min内纪录结果。8对照组的设置(1) SPA阴性菌标记免疫血清对照。(2) SPA阳性菌标记正常血清对照。(3) SPA稳定液与炭疽杆菌凝集对照。(4) 抗炭疽血清与炭疽菌凝集对照。(5) 其它芽胞杆菌凝集试验对照。（四）结果判定强度以“”表示： 2min内，菌体凝集成大颗粒，液体透明。 ： 2min内，菌体凝集成较大颗

19、粒，液体透明。 ： 2min内，菌体凝集成较小颗粒，液体轻度透明。 ： 2min菌体部分凝集成细小颗粒,液体混浊。 ：2min内，无凝集现象，或2min以上才能出现细小颗粒者。四、SPA 酶联免疫吸附试验（SPA-ELISA）(一) SPAELISA技术原理SPA 能天然地与人及某些哺乳动物的IgG分子上的Fc片段结合，一个分子的SPA可以同2个IgG分子以化学共价键结合(这不是真正的免疫反应，又称为假免疫反应)，利用这个特性，以SPA代替IgG抗体而应用于ELlSA中。(二) 材料与试剂1SPAHRP结合物,可向有关生物制品厂购买，也可自制，制法如下：(1) 取5mg HRP(RZ=3.0)

20、溶于1ml新配制的0.3mol/L pH8.1 NaHCO3液中。(2) 加入0.1ml用无水乙醇配制的1%的1荧光2，4二硝基苯，室温(20)温和搅拌1h。(3) 加入1ml0.16mol/L 乙二醇，室温搅拌1h。(4) 以0.01mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液充分透析。(5) 加入经0.01mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液平衡的SPA 5mg/ml，于20温和搅拌2h3h。(6) 加入5mg KBH4，混匀后，4放置3h。(7) 以0.05mol/L pH 7.4 PBS透析过夜。(8) 过Sephadex G100柱(100cm2cm)，以0.5mol/L pH7.4 PBS液

21、洗脱，流速10ml/h。(9) 测OD403nm，集SPAHRP活性部分。(10) 将高活性组分合并，加入甘油(含30%)置低温保存。也可以采用过碘酸钠法，制法如下：5mg HRP溶于1ml新配制的0.3mol/L pH 8.1的NaHCO3液中；加入无水乙醇配制1%1荧光2,4二硝基苯0.1ml，室温混合1h；加入1ml0.6mol/L NalO4(蒸馏水配制)室温中混合30min；加入1ml0.6mol/L乙烯乙二醇(蒸馏水配制)，室温缓慢混合1h；以0.01mol/L pH9.6 NaHCO3缓冲液于4透析过夜；加入透析液平衡的SPA液5mg/ml,室温缓慢混合3h即可。(11) SPA

22、HRP活性测定：取猪血清IgG10g/ml 0.1ml包被反应板，4过夜，33min冲洗；加入适量稀释的SPAHRP溶液0.1ml，置372h，冲洗33min；加入底物显色，显色的深浅应与SPAHRP的活性成正比。2稀释液 0.05Mol/L pH7.4PBS液。3包被液 pH9.6碳酸盐缓冲液。4洗涤液 0.02Mol/L7.4TrisHCl缓冲液。5底物溶液 pH 5.6磷酸盐柠檬酸缓冲液：0.2mo l/L Na2 HPO4(28.40g/L) 25.70ml0.1mol/L 柠檬酸(19.20g/L) 24.30mlH2O 50.00ml用前加40mg邻苯二胺,溶解后加30%H2O20

23、.15ml。6终止液 2mol/L H2SO4 1滴。（三）操作方法1检测抗体 包被：用pH9.6碳酸盐缓冲液将抗原稀释成50g100g/ml，每孔加0.1ml，37感作2h后置4过夜。 洗涤：以pH 7.4 TrisHCl液洗涤33min。 加样：用pH 7.4PBSTween液稀释被检样品，每孔0.1ml，37感作2h。 洗涤33min。 加SPA SPA经pH7.4 PBSTween液稀释后，每孔加入0.1ml，3730min。 洗涤33min。 加底物：每孔加底物0.1ml，置室温15min(避光)，再加2mol/L H2SO40.05ml(1滴)终止反应。2检测抗原 包被：以抗体包被

24、,此抗体必须用SPA不能结合的那些动物的lgG,否则会因为SPA同包被抗体结合而产生假阳性结果,包被条件同上。 洗涤。 加样。 洗涤。 加抗体：此抗体必须选用能与SPA结合的动物IgG，否则可因为SPA不能同此层抗体结合而发生假阴性结果。 洗涤。 加SPA。 洗涤。 加底物及终止反应。3检测培养细胞内病毒抗原 盖玻片培养单层细胞。 接种易感病毒。 用甲醇固定细胞。 加抗血清于盖玻片上,37孵育1h。TrisHCl液33min洗涤。 将PPA滴加在盖玻片上,37孵育30min。 洗涤33min。 将盖玻片置底物溶液中,室温15min。 以pH7.4 TrisHCl液稍加冲洗后即可镜检。(四) 结

25、果判定1检测抗体或抗原 眼观判定：在对照组成立的前提下,和标准阳性孔相近颜色者,均判为阳性()。 酶标仪测定：以空白对照孔调零，标准阳性样品校正至某一规定值，测定待测孔，当待测孔OD值或计算值达某一规定阈值时，判为阳性。2检测培养细胞内抗原 镜下观察，凡细胞内或细胞膜上出现棕黄色颗粒者，判为阳性。（五）注意事项1目前使用的聚苯乙烯塑料板对抗体的吸附性能较好,，因此对于抗原，特别是大分子(分子量100万)的抗原应该进行一些适当的处理,如DNA,应将其事先冻融，使其变成较小分子再包被，如脂蛋白则应改变包被的温度，可在37包被过夜。2由于SPAELISA的敏感性极高，因此也很容易出现非特异性显色,排

26、除非特异性显色的方法除了纯化抗原抗体外，还应该注意：抗原包被后，再以牛血清白蛋白包被一次或稀释液中加入1%的牛血清白蛋白均可，以占据未包被的一些空隙。检测血清抗体时，需事先检测大标本量的正常血清效价水平，在检测待检标本时，减去正常的血清效价。ELISA法加入标记物后往往37孵育2h，SPA同IgG的结合不是免疫反应，而是一种化学反应，一般认为，这种结合可能在极短的时间内发生,所以加PPA后，孵育时间可以缩短到0.5h。孵育过久，反而可因为SPA本身吸附到反应板上，造成非特异性显色。3叠氮钠对SPA显色影响较大，所以在SPA-ELISA过程中，不宜加叠氮钠做防腐剂，在组织细胞培养固定，也不适宜用甲醛固定，而需采取甲醇或乙醇。五、SPA提取IgG(一) 原理 将SPA偶联至Sepharose4B上后，利用亲和层析来提取人和某些动物的IgG，这样可以省去制备