DNA的复制幻灯片

1、 第四章 DNA的复制 The Replication of DNA 第一节 概述一、DNA复制原则半保留性复制 DNA复制方式有三种可能性，即全保留、半保留和分散式。 Meselson等的氮同位素试验 证明了DNA复制为半保留复制机理。二、 DNA复制方向单向复制，即只形成一个复制叉（replication fork）双向复制，即形成两个复制叉。如E.coliDNA等。都是53方向合成三、复制起始点（origin） 原核DNA只有一个复制起始点（ori），而真核DNA上一般有多个ori。现细菌、酵母以及线粒体、叶绿体的DNA复制起始点已克隆，并测序，发现其共同点都富含A、T序列，认为这可能与

2、复制起始时起始点处DNA双螺旋的解旋有关，是引发复制的蛋白因子的结合部位。复制子（replicon）DNA分子中能独立进行复制的单位称为复制子。四、 DNA复制方式凯恩斯模型（型）（ Cairns model ）双链环状DNA的复制方式。拓扑异构酶 I在环形DNA中，整个结构象字母，称为结构。2.环状DNA的滚环复制 Rolling Circle Mechanism for Replicating Circular DNA 许多病毒DNA，细菌F因子(F factor)等用滚环复制方式进行 DNA扩增。 535353533. 染色体DNA复制方式 多复制子复制，即DNA上先形成多个复制眼，双向

3、复制。“眼”扩大互相相连，形成“大眼睛”最后完成整个DNA的复制，形成两个DNA分子553355335353 染色体末端的复制35重链轻链4. 线粒体DNA复制方式 D环复制模型五、DNA的半不连续复制 双螺旋DNA两股链的极性是相反的，因此在复制叉上进行互补链的合成极性也应是相反的。但现发现的DNA聚合酶的作用都是53聚合。 在复制过程中如何解决这一问题？ 1968年，冈崎（Okazaki）的实验（一个是同位素标记；另一个是电子显微镜观察）发现在DNA复制时，总是一条链先完成，另一条链随后。两条模板链中，以35方向为模板其子链合成是连续的，这条子代DNA叫先导链（leading strand

4、），以53方向为模板的链是不连续合成的，随着复制叉的移动要先合成小片段，然后连起来，这条子代DNA链叫滞后链或随后链（lagging strand）。故称半不连续复制。 在随后链合成时，先合成的DNA小片段称之为冈崎片段。 第二节 DNA复制系统DNA复制系统是指参与DNA复制的酶和蛋白因子。1. DNA聚合酶：催化反应的要点： 底物：四种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） 模板：DNA单链 聚合方式：按照碱基配对原则，将相应dNTP的5磷酸与上一个核苷酸的3 羟基形成3 5磷酸二酯键，即合成方向为5 3，与模板链反平行 。 条件：聚合反应必须有引物存在。DNA聚合酶的基本功能

5、酶并不直接识别碱基，而是通过碱基配对来识别掺入的碱基是否正确。当一脱氧核苷酸掺入DNA后，酶并不立即与模板脱离，而是继续作用，这一性质称为持续性（processitivity）。IIIIII亚基数1410M.W103 00088 000830 000聚合作用连续聚合作用小较小很大聚合速度(N/s)162040250100053 外切酶35 外切酶功能复制中去除引物填补缺口参与损伤修复可能参与损伤修复DNA复制的主要酶（1）大肠杆菌DNA聚合酶：共有三种， 为DNA聚合酶 I、II、III。DNA聚合酶 I (Kornberg 酶)（DNA Polymerase I, Pol I）基本特性：分子

6、量：109 kD；具DNA聚合酶活性，掺入一dNMP后，不立即脱离，可持续作用；具3-5核酸外切酶活性，由具有-OH的不配对核苷引发该活性；具5-3核酸外切酶活性，由具有切口的双螺旋DNA片段引发；主要功能是修复Klenow 片段：Pol I 可被枯草杆菌蛋白酶裂解为大小两段，其中较大的C段含DNA结合部位，具聚合酶活性和3-5核酸外切酶活性。3-5核酸外切酶活性:由具有-OH的不配对核苷引发该活性。是所有DNA聚合酶的共同特性。每个碱基对发生错配的几率是10-3，而在细菌中的实际发生几率为10-810-10。校对（proofreading）：指在核酸或蛋白质合成过程中，在碱基或氨基酸已经加入

7、链中后，对其进行识别并纠正错误的任何机制。校对通常可使错误率降至10-510-7DNA聚合酶酶的校对功能5-3核酸外切酶活性，由具有切口的双螺旋DNA片段引发。是DNA Pol I特有的活性。Pol I 的实际功能是修复DNA受损后，内切酶会在损伤部位切出切口，切口出现可激活5-3核酸外切酶活性，切除损伤部位；同时聚合酶开始工作，使DNA链和切口都向3方向延伸，这一现象称为切口转移（nick translation）;5-3外切活性也会切除新合成DNA 5端的RNA引物和填补形成的缺口。为什么是53 ？OHPPPPPPOHO53OHPPPOHOOH53OHOHPPP?OH53亚基分子量（kD）

8、基因组装层次130dnaE27.5dnaQ10*71dnaX*47.5dnaX3533151240.6dnaNPol IIIPol IIIPol III*Pol III全酶DNA聚合酶III (DNA Polymerase III, DNA Pol III) E. coli中的DNA复制酶是DNA Pol IIIDNA聚合酶的一般结构“右手”结构：拇指（thumb）手指（finger）手掌（palm）DNA位于手掌上由拇指和手指形成的槽中。abgdMW11012000 4500060000 122000 亚基数48个 一条肽 四个相同亚基 一条肽 35外切酶活性 无无无有功 能复制的主要酶，与

9、随后链合成有关DNA损伤修复线粒体DNA的复制复制的主要酶，与先导链合成有关（2）真核生物DNA聚合酶： 共有四种，为DNA聚合酶a、b、g、 d2. 引物酶（primase） 功能：以DNA为模板，催化合成一小段与DNA互补的RNA ，即引物。引物：1060个核苷酸引物酶本身无活性，只有与另外6种蛋白质结合为引发体（primosome）才可催化引物的合成。 dnaB是六聚体。在ATP、Mg2+存在时可与6个dnaC结合成复合体。此复合物在i-蛋白协助下与结合在单链DNA上的n、n、n”组成引发前体。引发前体再与引物酶结合则形成引发体。n可选择DNA特定位置在其上组装引发前体和引发体。引发体可

10、沿DNA链53移动到一定位置即可合成引物。移动和引发由ATP供能n有ATP酶活力。DnaB可识别与DNA结合的起始位置。BCCBinn nDNAnn nDNACBinn nDNACBi引发酶引发酶 引发体蛋白性质与功能引物体蛋白MW亚基数功 能引物酶600001合成引物DnaB3000006可移动的启动因子、ATPaseDnaC*250001预引发n预引发nATPase、识别起点n 110001预引发i参与引物合成* 引发体中含6个DnaC实验证据噬菌体M13的复制对转录抑制剂敏感；每一冈崎片段都产生一个RNA-DNA接头。RNA引物的作用防止复制起始时出错率高造成的致命突变3. DNA连接酶

11、 （ligase） 功能：将复制过程中形成的DNA片段用3 5磷酸二酯键连接起来。酶酶（部分细菌）DNA连接酶冈崎片段形成后，其5端的RNA引物被DNA Pol I合成的DNA通过切刻平移取代，新形成的切刻（nick）由DNA连接酶（DNA ligase）封闭。DNA修复中产生的切刻由DNA ligase 封闭。GapNick4. DNA解螺旋酶(helicase)（解链酶） 功能：DNA的双螺旋解链，解开一对碱基，需2分子ATP， 作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。 种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。 I、II、III中任一种沿模板5-3 方向移动，r

12、ep蛋白沿模板3 -5方向移动。5353repII53553 MW：74000，四聚体 可与由解链酶解开的单链结合 功能：防止单链再次形成双链，防止核酸酶水解多核苷酸链，保护DNA。 原核SSB对单链DNA结合有高度协同性，即初步结合可使后者更容易，一条链上一次可结合多个SSB，真核SSB无协同性，可能机制不同。 可以重复使用，即当所结合的单链进行复制时，它就发生解离，而与新解开的单链结合。5. 单链结合蛋白（single strand binding protein SSB）解螺旋酶（helicase）：大肠杆菌中有解螺旋酶和Rep蛋白单链结合蛋白（single-strand binding

13、 protein，SSB）结合于单股DNA，使其保持伸展。6. DNA拓扑异构酶（topoisomerase）分：拓扑异构酶 I和拓扑异构酶II 拓朴异构酶I 首先在大肠杆菌中发现，过去称为-蛋白，分子量为110000，一条肽链，它可切断DNA一条链，增加一个螺旋，再接起来，所以它可消除负超螺旋，也可增加正超螺旋，不需供给能量。 拓扑异构酶 I 的功能（1）双链DNA超螺旋与松弛态的相互转换 （2）单链结状DNA和环状无结状DNA的相互转换 （3）单链互补环状DNA正、负链形成环状DNA（4）双链环状DNA环连或解环连拓扑异构酶II E.coli中，MW=1400000为四聚体，A2B2，真核

14、生物中该酶分子量为390000二聚体，它可使DNA两条链同时断裂，然后再连接，结果引入负超螺旋，这是需能过程。能量由ATP供给。 超螺旋的松弛和旋转酶对DNA双链的拆分将导致拓扑学障碍。这一障碍在大肠杆菌中由Topo II ( gyrase )解除。（-） （+）组成：蛋白质与RNA(是一种核糖核蛋白）性质：两个亚基，一个为催化亚基，另一个为调节亚基功能：以酶分子中的RNA片段为模板，在染色体DNA3-端合成一段DNA7. 端粒酶（telomerase）生理意义：由于复制过程中，3-端引物切除以后聚合酶I无法填补，就造成了3-端的缩短。端粒酶可以补充染色体末端的自然丢失，防止细胞衰老。 5TT

15、GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG 3 AACCCC 5TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG3 AACCCCAACCCC5TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG3 AACCCCAACCCCAACCCC 3-AACCCCAAC-5 端粒酶3-AACCCCAAC-5 端粒酶3-AACCCCAAC-5 端粒酶 第三节 DNA复制过程一、原核生物DNA的复制 1. 174噬菌体DNA的复制 噬菌体是DNA复制研究中的一个重要实验系统。 噬菌体DNA复制是在进入宿主细胞后利用宿主细胞的原料、成分进行的。 174基因组是一个含5 3

16、86个核苷酸的单链环状DNA（+链）。174 DNA的复制策略：分三个阶段.以原DNA（+）链为模板合成互补（）链，然后形成双链DNA（SSRF）。这种双链DNA称复制型（replicative form，RF）。.双链DNA的繁殖：（RFRF）.新病毒（+）链的产生：（ RFSS）. 174以（+）链为模板合成（）链,需依靠宿主的酶和有关蛋白。首先需引物体参与，其引物体由7种蛋白组成：priA、priB、priC、DnaB、DnaC、DnaG、DnaT。 174DNA在接近2 300位处有一个由44个核苷酸组成的发夹结构，与引物体形成有关。PriAPriBPriCDnaBDnaCDnaTDn

17、aB-DnaC复合物ATP, Mg2+ 移动 识别ATPADP 组装前引物体引物酶（DnaG）引物体 引发 切除Pol 连接酶 延伸Pol 全酶X174 （）链DNA的合成. （RFRF）与（ RFSS）： 在（+）链合成时涉及到两种蛋白，一是噬菌体基因A编码的蛋白（gpA）；另一种是大肠杆菌的Rep蛋白。 gpA是一60kD的蛋白，对174的（+）链原点具有专一性的核酸内切酶活力的蛋白，引发复制的起始。正链合成滚环（rolling circle）复制模型在原点割切；共价延伸；切下被替换的单链。X174 (+) 链DNA的复制1、gpA在特异位点切割；2、Rep 使5端解链；3、在Pol 作用

18、下，原（+）链3 端进行共价延伸；4、复制一周后，由gpA进行切割、连接，使置换出的单链切下，并形成环状分子进行包装。( gpA )由上述过程可见， 174的（）链合成是不连续的，相当于大肠杆菌随后链的复制； （+）链的合成是连续的，相当于大肠杆菌先导链的复制。总结：（）+中期后期滚环复制新病毒+（）（）+ 2.大肠杆菌的DNA复制 大肠杆菌的DNA是一双链环状DNA，它的复制是从单一原点开始，按双向的型方式进行复制。 复制的起始 E.Coli DNA很小，只有一个复制起点oriC，位于天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操纵子之间，由245bp组成。含两个重复单位，一是3个13bp的重复序列，另一是

19、4个9bp的重复序列，并富含AT。 13 13 13 9 9 9 9复制原点序列特征4个9 bp重复序列，3个13 bp重复序列，都富含A-T对。 首先是DnaA蛋白识别和结合在oriC的9bp重复单位形成复合物，由2040个DnaA蛋白形成核心，负超螺旋的oriC包裹在外。随后DnaA蛋白使13bp区溶解，形成开放性复合物。开放性复合物的形成除需DnaA蛋白外，还需ATP。此时DnaB蛋白和DnaC蛋白进入DNA溶解区。 DnaB蛋白为解螺旋酶，使DNA双向溶解形成复制叉，并使引物酶和RNA聚合酶进入，参与先导链上的引物合成。此外，SSB和旋转酶也参与了这一过程。 复制的延伸 随着复制起始中

20、结构的形成，许多酶和蛋白质相继进入复制叉，在复制叉形成复制体（replisome）。不同系统中，复制体的组分虽有差异，但其功能十分相似。解螺旋酶使DNA双链分开和复制叉前进，旋转酶解除由此产生的正超螺旋张力，DNA单链由 SSB覆盖，形成作为模板所需的伸展构象。前导链上开始DNA的连续合成，随后链上的不连续合成，以及引物的切除、缺口的填补和封口。先导链与后随链的矛盾如何解决？ 根据计算，每一复制叉仅含1个DNA聚合酶全酶，这说明前导链和随后链上的DNA合成是由同一复制体负责的。但DNA两股链上的DNA合成不是同步进行的，并且方向相反，那么复制体是怎样工作的呢？为此提出了模型认为：当前导链上开始

21、DNA合成和复制叉向前移动时，随后链即向后回折成环，并与聚合酶的另一个活性中心按前导链的取向缔合。在这样的结构中，PriA和DnaB蛋白是两个关键组分。DNA聚合酶III (DNA Polymerase III) 及其组装：核心酶（core enzyme）：二聚体聚合：DNA装载？：持续性因子Replisome model复制体（replisome）主要蛋白DnaBgyrasePol IIIDnaGPriASSB功能解螺旋酶旋转酶复制酶引物酶引发位点识别保持单链伸展冈崎片段的不连续合成当聚合酶遇到前面片段时，核心酶与亚基分离；在下一个起点则重新结合一个亚基。冈崎片段的连接DNA Pol I，l

22、igase 复制的终止 复制的终止还是一个尚不清楚的问题，大肠杆菌的基因组是一环型DNA，它的复制终止位点约相对于原点。当大肠杆菌DNA复制进行到一特定区域后，复制叉的移动会由于这一区域两侧的核苷酸序列而放慢移动速度，从而协调两复制叉到达的时间。在复制的最后阶段，大肠杆菌的环型DNA会产生两个相互套接在一起的环。拓扑异构酶在这里发挥了重要的作用。大肠杆菌DNA复制的终止Figure 13.16 Tus binds to ter asymmetrically and blocks replication in only one direction. Figure 12.7 Replication termini in E. coli are located beyond the point at which the replication forks actually meet. 环形分子的终止形成连环分子（catenane）? 二、真核生物DNA的复制 1.特点： （1）真核细胞DNA复制受细胞外信号的调控（专一性生长因子）。（2）真核生物的DNA具有多个复制起点。酵母DNA的复制原点称自主性复制序列（autonomously replicating sequence， ARS)，酵母DNA上约含400个ARS。 ARS由两个功能域组成：功能域A含11bp，是ARS的核心；功能域